2. Một số công nghệ khác
2.3. Xác định giới tính của phơi
Đây là một kĩ thuật hiện đại nhằm chuyển nhân của một tế bào phôi sớm vào một tế bào trứng đã tách nhân đi để tạo nên tế bào lưỡng bội (“hợp tử”) và phát triển thành phơi.
Qui trình kĩ thuật này bao gồm các bước sau:
- Tạo phôi cho nhân: để tạo phôi cho nhân người ta gây siêu bài noãn, thụ tinh, rồi giội rửa lấy phôi ra, tốt nhất là ở giai đoạn phôi dâu 16 - 32 tế bào.
67
- Tách khối tế bào phôi dâu thành từng tế bào riêng rẽ.
- Cấy mỗi tế bào này vào một tế bào trứng khơng nhân đã được chuẩn bị trước (có thể lấy ở các lị mổ hoặc ni cấy in vitro).
- Nuôi cấy in vitro những tế bào trứng đã ghép nhân hoặc đưa vào nuôi ở vật nhận trung gian (thường là thỏ hoặc cừu).
- Sau một thời gian (tùy lồi) đem các phơi đã phát triển này cấy vào các vật nhận đã được gây động dục đồng pha hay đem đông lạnh hoặc nhân lên lặp lại để thu được nhiều phôi hơn.
Phương pháp chuyển ghép nhân tạo nên các dịng vơ tính đã thành cơng ở nhiều lồi vật ni như cừu, bị, ngựa, heo, dê.
Kĩ thuật này đem lại hiệu quả cao trong nhân giống, trong cải tiến di truyền các giống vật nuôi. Chẳng hạn như Nicholas và Smith (1983) đã nghiên cứu việc tạo các dịng vơ tính trong nhân giống bị sữa đã ước tính rằng có thể đạt được sự gia tăng về di truyền đối với sản lượng sữa là 15 - 25% (tương đương với kết quả của 10 - 12 năm chọn lọc).
2.4. Tạo ra động vật chuyển gen
Có thể hiểu chuyển gen là việc chuyển những gen đã được tái tổ hợp in vitro
vào cơ thể khác (ở đây được hiểu là cá thể vật nuôi).
Từ năm 1980 khi mà lần đầu tiên, thực nghiệm chuyển ghép gen thành công nhờ vi tiêm ADN vào tiền nhân của hợp tử chuột nhắt được thơng báo, thì phương pháp cho phép chuyển một gen đô nhất đã tách ra được xây dựng (Gordon et al, 1980).
Nhờ áp dụng các phương pháp sinh học phân tử này, các gen được quan tâm cho mục đích chọn giống có thể được tách ra, giải trình tự, tái tổ hợp với các thành phần điều hòa, khảo nghiệm in vitro và in vivo về hoạt động của chúng.
Việc thực hiện đầy đủ những nghiên cứu cơ bản này trong các chương trình nhân giống vật ni chỉ vừa mới bắt đầu và được dự đốn là sẽ có những biến cố nổi bật trong tương lai.
Đã có nhiều kĩ thuật được xây dựng để cho phép chuyển gen ở động vật, trong đó kĩ thuật vi tiêm ADN vào tiền nhân của hợp tử đã được áp dụng ở nhiều lồi vật ni như cá, thỏ, dê, cừu, heo và bị.
Qui trình kĩ thuật vi tiêm ADN ở động vật có vú bao gồm các bước sau: - Tái tổ hợp và tách dòng gen quan tâm.
68
- Phát hiện các hợp tử.
- Làm trông thấy được tiền nhân. - Chuẩn bị dung dịch ADN để tiêm.
- Vi tiêm dung dịch ADN vào tiền nhân của hợp tử.
- Chuyển hợp tử đã được tiêm vào tử cung của vật nhận đã được gây động dục đồng pha.
- Kiểm tra con vật mới sinh ra xem có gen lạ xen vào hay khơng.
Trong quá trình này, vật cho được siêu bài nỗn bằng kĩ thuật tiêm kích tố sinh dục gonadotropin (theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài) và được thụ tinh.
Việc thu nhận các hợp tử được thực hiện 12 - 14 giờ sau khi thụ tinh qua xối nước ống dẫn trứng.
Li tâm là phương pháp thơng dụng để có thể nhìn thấy tiền nhân…
Việc xây dựng các gen cần tiêm được tái tổ hợp với các plasmid và sau đó được tách dịng.
Sau khi tách ADN vectơ đã tái tổ hợp bằng enzym giới hạn, gen nghiên cứu được chiết ra, tủa rữa và đưa vào buffer tiêm.
Tất cả các dung dịch được sử dụng trong quá trình chuẩn bị dịch để tiêm phải tuyệt đối vô trùng.
Dung dịch ADN gen phải không bẩn và được pha loãng để 1 microlit chứa khoảng 1000 bản sao gen.
Thiết bị cần thiết cho vi tiêm gồm 1 kính hiển vi, hai máy vi thao tác và thiết bị tiêm. Những bộ phận bổ sung là buồng tiêm, giá đỡ và pipette tiêm.
Pipette tiêm có đường kính khoảng 1 - 2m được đổ đầy dung dịch ADN. Trong quá trình tiêm, hợp tử được đỡ bằng pipette đỡ.
Pipette tiêm được đưa vào tiền nhân qua màng tế bào và màng nhân. Khoảng 1 – 2 microlit dung dịch ADN được tiêm vào tiền nhân làm cho thể tích của nó tăng lên.
Những hợp tử đã được tiêm sau khi nuôi cấy in vitro được chuyển vào ống dẫn trứng của vật nhận đã được gây động dục đồng pha.
Sau khi các con đã được vi tiêm ADN sinh ra, ADN hệ gen được tách khỏi mơ (máu hoặc các tế bào có thể lấy ra một cách thích hợp từ đi) để xác định xem việc xen gen vào có kết quả hay khơng. Sự xen gen có thể được kiểm tra
69
bằng kĩ thuật Southernblot hay PCR. Các vị trí xen gen vào nhiễm sắc thể có thể được thăm dị qua lai nhiễm sắc thể kì giữa với việc sử dụng gen đã tiêm làm probe (mẫu dò).
Các động vật chuyển gen được nuôi và giao phối với nhau. Đời con của những cặp giao phối này được kiểm tra để xem có gen được chuyển hay không. Trong số những con này chú ý chọn ra những con đồng hợp về gen được chuyển.
2.4.1. Chuyển gen ở một số lồi vật ni
Trong thư mục đã có những thơng báo về vi tiêm ADN vào tiền nhân của hợp tử thỏ, heo, cừu, dê, bò và cá.
- Thỏ: đã được sử dụng làm mơ hình thực nghiệm trong chuyển gen. Năm 1985, những thông báo đầu tiên về việc sản xuất thành công các con thỏ chuyển gen MT-hGH do Hammer và những người cộng tác thực hiện. Tỉ lệ thối hóa các hợp tử thỏ do việc vi tiêm ADN là dưới 10% (Ross và những người cộng tác, 1988). Khả năng phát triển ở thời kì tiền cấp ghép của các hợp tử đã tiêm thấp hơn nhiều so với đối chứng.
- Heo: trong các hợp tử đã tiêm AND, 6 - 11% phát triển và đã sinh ra heo con (Hammer và cộng sự, 1985). Tỉ lệ xen gen lạ ở heo là gần 10%. Gen hGH được sử dụng trong các thực nghiệm đầu tiên có tỉ lệ biểu hiện 50%. Đã thu được heo lai F1 về gen được chuyển. Đặc biệt đã thấy sự di truyền gen được chuyển ở 2 trong số 5 heo khảo nghiệm (Hammer và cộng sự, 1988).
- Cừu: khơng cần ly tâm cũng có thể thấy được tiền nhân của hợp tử cừu. 80% tiền nhân có thể định vị nếu kính hiển vi có độ phản quang rõ. Chỉ 19% hợp tử sau khi vi tiêm ADN phát triển đến giai đoạn 32 tế bào. Trong những thực nghiệm đầu tiên, tỉ lệ xen gen lạ khoảng 1% (Hammer và cộng sự, 1985; Ward và cộng sự, 1986), trong khi tỉ lệ sống sót của những phơi đã tiêm là 7%.
- Dê: cũng đã có những thí nghiệm thăm dị việc vi tiêm ADN vào hợp tử dê. Tuy nhiên, không phát hiện được các gen lạ đã tiêm ở những con đã sinh ra (Aumstrong và cộng sự, 1987; Fabricaut và cộng sự, 1987).
- Bò: Lohse, Roll và First (1985) đã vi tiêm gen Thymidine - Kinase vào hợp tử bò và chỉ ra 24 giờ sau khi tiêm khoảng 30% phơi có gen Thymidine - Kinase. Roschlau và cộng sự (1985) đã vi tiêm 3 gen có nguồn gốc virút khác nhau vào 513 hợp tử bò và đã phát hiện được ADN lạ trong 14 phôi.
- Cá: chuyển gen vào phôi cá đã được thực hiện ở một số loài (cá hồi, cá chép, cá rô Phi, cá vàng, cá ngựa, cá chạch, cá trê). Trong nhiều trường hợp, tiền nhân của hợp tử khơng thể nhìn rõ nên vi tiêm phải được thực hiện vào bào chất của phôi sớm. Một số thông báo đã chỉ ra rằng ADN tiêm đã tái bản nhanh chóng
70
trong pha sớm của sự phát triển phơi. Sự sống sót của các phơi đã tiềm tương đối tốt và nhiều con đã đạt tới tuổi thành thục. Tỉ lệ các con chuyển gen dao động từ 1 - 50% hay nhiều hơn tùy loại và các nhân tố thực nghiệm khác.
2.4.2. Nhân giống với các gia súc chuyển gen:
Khi áp dụng kĩ thuật chuyển gen trong các chương trình nhân giống gia súc, điều quan trọng là gen được chuyển phải được di truyền tiếp cho hậu thế. Tức là, hầu hết hoặc ít ra một số tế bào phơi của các con vật sinh ra do chuyển gen phải chứa gen được chuyển.
Hiện tại cịn biết rất ít về các quá trình sinh học phân tử đã xảy ra khi ADN tiêm được xen vào hệ gen ví dụ, thời gian chính xác của việc xen gen vào cịn chưa biết và ngay cả sự kiện này có ổn định ở tất cả các tế bào trong quá trình phát triển phôi hay không.
Khi gia súc đã chuyển gen sinh ra được kiểm tra, đặc biệt là trong việc sinh ra đời sau, người ta thấy có thể gặp các thể khảm, tức là các con vật, có các dịng tế bào khác nhau về kiểu gen, mặc dầu nó bắt đầu từ một hợp tử. Các thể khảm do chuyển gen gồm 2 loại tế bào: có gen được chuyển và khơng và điều này đơi khi khó hiểu. Hiển nhiên là đời sau khơng thể được di truyền gen được chuyển từ cha mẹ nếu gen được chuyển khơng có trong tuyến sinh dục. Từ những thực nghiệm đã tiến hành, khoảng 30% số động vật được chuyển gen là thể khảm như vậy.
Thơng thường thì hiện tượng khảm hợp chỉ thấy ở Fo. Đời con F1 và các thế hệ tiếp theo sẽ phải có gen được chuyển ở tất cả các tế bào xoma và tế bào sinh dục. Song thực tế, đã thấy là gen được chuyển hiếm khi di truyền qua các thế hệ sau. Lý do vì sao gen được chuyển khơng cịn xen một cách ổn định ở các thế hệ sau, hay có thể mất khỏi bộ gen đơi khi khó giải thích. Có thể rằng hiện tượng này xảy ra là do khả năng methyl hóa của ADN ở các mức khác nhau.
2.4.3. Những khả năng ứng dụng chuyển gen.
Cho tới nay, chuyển gen mới chỉ có thể làm ảnh hưởng tới các tính trạng đơn gen hoặc các tính trạng do một số ít gen kiểm sốt. Tuy nhiên, có rất ít các tính trạng được các nhà chọn giống quan tâm là đơn gen. Song, sự sai khác giữa các tính trạng chất lượng và số lượng khơng phải bao giờ cũng rõ ràng như một trong các tính trạng số lượng cổ điển trong chọn giống động vật đã được Palmiter và những người cộng tác (1983) biến đổi để trở thành hầu như chất lượng qua chuyển gen kiểm soát tổng hợp Hormone sinh trưởng liên quan tới cơ chế điều hòa feed back. Hậu quả tương tự cũng có thể dự đốn nhờ áp dụng đối với somatotropin ở bò sữa.
71
Hiện tại, việc nghiên cứu trong lĩnh vực chuyển gen ở gia súc đang tập trung vào các hướng sau:
- Sinh trưởng, những cố gắng làm tăng sự sinh trưởng và cấu tạo cơ thể động vật qua việc chuyển gen kiểm sốt sự điều hịa hormone sinh trưởng. Những thực nghiệm với các proteohormone tương ứng trong sự sinh trưởng của động vật đã chỉ ra rằng hiệu quả như vậy có thể đạt được.
Năm 1990, Peijung zhang và những người cộng tác đã vi tiêm gen RSV- rtGH-cADN (Rous sarcome virus, rainbon trout Growth Hormone - ADN) vào trứng đã thụ tinh của cá chép. Trong số 365 cá chuyển gen được phân tích thì 20 con có RSV-rtGH-cADN trong bộ gen của chúng. Mặc dầu có sự sai khác đáng kể về kích thước giữa các con cá chuyển gen, song những con đã được vi tiêm trung bình lớn hơn 22% so với đối chứng. Những con được chọn ngẫu nhiên từ các phép lai giữa các con đực chuyển gen và các con cái không chuyển gen đã được di truyền ADN lạ. Các con chuyển gen này lớn nhanh hơn so với anh chị em ruột không chuyển gen của chúng.
Những thực nghiệm chuyển gen như vậy đã được dự kiến làm trên heo (Hammer và cộng sự, 1985; Vize và cộng sự, 1987) và cừu (Ward và cộng sự, 1986).
- Sức đề kháng với bệnh.
Mới chỉ có rất ít gen, được biết là có khả năng ảnh hưởng tới sức đề kháng của vật ni đối với bệnh. Mơ hình cho cơng việc như vậy là sức kháng bệnh cúm được gây nên bởi gen Mx (Stacheli và cộng sự, 1986). Các tác giả đã cố gắng để tạo ra các heo kháng bệnh cúm qua việc chuyển 3 gen Mx.
- Cải tiến chất lượng sản phẩm.
Việc cải tiến chất lượng hay thành phần cấu tạo các sản phẩm của động vật qua việc chuyển các gen tương ứng có thể đưa ra những triển vọng mới mẻ cho sản xuất trong chăn ni. Mơ hình do Mercier (1987) đưa ra làm giảm lượng lactose tổ hợp với promoter đặc hiệu bầu vú, thì lactose sẽ tách thành galactose và glucosa. Sữa như vậy được tiêu thụ cho một tỉ lệ lớn dân số thế giới mắc chứng không dung nạp lactose.
Qua chuyển gen, các nhà nghiên cứu cũng đã cố gắng để làm tăng sự tổng hợp cystein trong cơ thể động vật có vú để làm tăng sản lượng len (Ward, Mueeay và Nancarron, 1986; Ward và cộng sự, 1986).
72
Có một số lý do để dự đốn rằng trong ít năm nữa có thể bắt đầu sử dụng gia súc chuyển gen để sản xuất một số lượng lớn ở trong sữa động vật các protein mà người cần cho điều trị bệnh. Những nghiên cứu với các gen -Lg cừu và -Cn
chuột cống đã chỉ ra rằng các gen này đã sản xuất protein tương ứng trong sữa chuột nhắt, cừu, thỏ và heo chuyển gen.