Chiết xuất DNA
DNA ựược chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle và Doyle, 1990), ựược cải tiến bởi bộ môn CNSH ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Trường ựại học Nông nghiệp Hà Nộị
- Hóa chất và ựệm:
+ DEB (DNA Extraction Buffer): 2% CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β - Mercaptoethanol. Hòa tan CTAB và các hóa chất khác trong nước cất 2 lần bằng cách ủ trong waterbath ở 65oC. Thêm 2 % β-Mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng.
+ TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0.
+ Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform: isoamyl alcohol (24:1), 100 % ethanol, 76 % ethanol.
- Qui trình chiết xuất DNA:
+ Thu các lá non vào buổi sáng, ựặt trên ựá lạnh và ựưa về phòng thắ nghiệm càng sớm càng tốt.
+ Cắt khoảng 100 mg mô lá vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 400 ộl DEB, tiếp tục thêm 400 ộl DEB và trộn ựều trước khi chuyển hỗn hợp vào tuble 1,5 ml. đưa ngay các tube vào ủ ở 65oC trước khi chuyển sang nghiền mẫu khác.
+ Ủ mẫu ở 65ỨC trong 1 giờ hoặc hơn. Ủ lâu hơn kết quả năng suất DNA pellet cao hơn, sạch hơn, trắng hơn (Aldrich và Cullis, 1993).
+ Chiết xuất với cùng thể tắch 25:24:1 (1:1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách ựảo ngược các ống trong 5 phút, sau ựó ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng, 12000 rpm ựể phân tách các pha, chuyển pha lỏng phắa trên sang một tube 1,5 ml mớị Từ bước này tránh vortex, hút ựi hút lại ựặc biệt qua các ựầu pipet thể tắch nhỏ, và bất cứ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
35
thao tác nào gây ra lực cơ học ựể tránh gây ựứt gẫy DNA (Herzer, 2001).
+ Chiết với cùng thể tắch 24:1, trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp rồi lật ngửa (inverting) tubes trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng, 12000 rpm, chuyển pha lỏng phắa trên sang 1 tube mớị
+ Tủa DNA với 2 - 2,5 lần thể ethanol lạnh 100 % sao cho nồng ựộ làm việc khoảng 70%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì ựặt mẫu ở - 20oC trong khoảng 20Ỗ ựến 2 tiếng hoặc qua ựêm nếu thấy cần thiết (Herzer, 2001).
+ Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút, tốc ựộ 12000 rpm. + đổ bỏ cồn, rửa pellet hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB. CTAB ựã ựược hòa tan trong ethanol, số còn lại ựược loại bỏ trong bước này (Aldrich và Cullis, 1993). Làm khô pellet trong không khắ khoảng 1h và hòa tan trong 50 ộl TẸ
+ Kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA bằng ựiện di trên gel agarose 1% ở hiệu ựiện thế 100V trong khoảng 15 phút. độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức ựộ ựứt gãy và nồng ựộ DNA tổng số.
Chạy PCR phát hiện gen Ty-3 sử dụng cặp mồi P6-25F2/R5
- Trình tự cặp mồi P6-25F2/R5 (Ji và cộng sự, 2007c):
+ P6-25-F2: 5Ỗ- GGT AGT GGA AAT GAT GCT GCT C - 3Ỗ
+ P6-25-R5: 5Ỗ- GCT CTG CCT ATT GTC CCA TAT ATA ACC - 3Ỗ
- Phản ứng PCR ựược tiến hành trong thể tắch 25 ộl gồm 2.5 ộl 2.5 mM hỗn hợp 4 loại dNTP, 5 ộl 5x buffer, 2.5 ộl 2.5 mM MgCl2, 0.1 ộl (0.5 units) GoTaq
DNA polymerase, 2.5 ộl mỗi mồi xuôi và ngược nồng ựộ 10 ộM, 2-5 ộl DNA khuôn, và nước cất.
- Chu kỳ nhiệt: 94oC trong 4 phút, 35 chu kỳ gồm 94oC trong 30 s, 53oC trong 1 phút, và 72oC trong 1 phút, sau các chu kỳ này là bước kéo dài ở 72oC trong 10 phút, sau ựó phản ứng ựược giữ ở 4oC.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
36
gel agarose 1.5% trong ựệm TAE 1 X, nhuộm với ethidium bromide và hiển thị dưới ánh sáng UV.
Chạy PCR phát hiện gen chắn chậm rin sử dụng cặp mồi C43F/R
- Trình tự cặp mồi C43F/R (Vrebalov và cộng sự, 2002)
+ C43F: 5Ỗ- GAC GGG AAC CAT TAG ATT TTA AAG ACA - 3Ỗ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ C43R: 5Ỗ- GTG TTA TCA ATA TTG CCA TAC TCT TCT TGA CAA - 3Ỗ - Phản ứng PCR ựược tiến hành trong tổng thể tắch 25 ộl gồm: 2.5 ộl 2.5 mM hỗn hợp 4 loại dNTP, 5 ộl 5x buffer, 2.5 ộl 2.5 mM MgCl2, 0.1 ộl (0.5 units) GoTaq DNA polymerase, 2.5 ộl mỗi mồi xuôi và ngược nồng ựộ 10 ộM, 2-5 ộl DNA khuôn, và nước cất.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: 940C trong 3 phút, 39 chu kỳ gồm 940C trong 1 phút, 560C trong 1 phút, 720C trong 30 giây, kết thúc bằng bước kéo dài ở 720C trong 5 phút.
- Các mảnh khuếch ựại bằng PCR sau ựó ựược phân tách bằng ựiện di trên gel agarose 2% trong ựệm TAE 1 X, nhuộm với ethidium bromide và hiển thị dưới ánh sáng UV.