CHƯƠNG III : PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
a. Nuôi cấy làm đồngđều tuổi giống:Dùng que cấy chuyển khuẩn lạcđã làm ròng
từ ống nghiệm thạch nghiêng đang được lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống
nghiệm mới.Để ống nghiệm trong tủ ấm, nuôi ủtrong 300C trong 2 ngày.
b. Nhân giống cấp 1: Hút 1 ml nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi
khuẩn, lắcđều. Hút 100μl dịch huyền phù vi khuẩn cho vào erlen 250 ml chứa 100
ml môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1.
c. Nhân giống cấp 2: Xác định mật số trong giống cấp 1 theo thời gian. Ở thời
điểm mật số vi khuẩn trong giống cấp 1ởgiai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyền
sang tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2.
Các bình ni cấy vi khuẩnđượcđặt trên máy lắc, lắc 150 vịng/phút,ở nhiệtđộ300C.
3.2.2. Tiến hành thí nghiệm
3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự tăng trưởng và phát triển 8 dòng vi khuẩn
a.Địađiểm nghiên cứu
Phịng thí nghiệm vi sinh, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, TrườngĐại học Cần Thơ.
b. Bố trí thí nghiệm: Ni cấy 8 dịng vi khuẩn trong môi trường BM/NO3-
Cho 1ml nước cất đã khử trùng vào 8 ống nghiệm thạch nghiêng chứa 8 dòng vi
khuẩn: P. stutzeri 6Rc, P. stutzeri D7a, P. stutzeri D3b, P. stutzeri TN5, P. stutzeri TN7, P. stutzeri 7Ra, P. stutzeri VT_B1b và vi khuẩn khử đạm AU11; lắc đều. Hút
100μl dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường BM/NO3-. Nuôiủ ởnhiệt độ300C, lắc 150 vòng/phút.Đếm mật sốvi khuẩnở
0 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 18 giờ, 28 giờ, 48 giờ ni ủ.
3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Sự tăng trưởng và khả năng oxy hoá ammonium; khử nitrat, nitrit của 8 dịng vi khuẩn
a.Địađiểm nghiên cứu
Phịng thí nghiệm vi sinh, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, TrườngĐại học Cần Thơ.
b. Bố trí thí nghiệm:400 ml BM/NO3-cho vào bình tam giác 1000 ml đượcđóng
chặt miệng bằng gịn khơng thấm, dung dịch muối VS (5 ml/l), PS-1 (5 ml/l) và vitamine V8 (1%) được thêm vào bình ởnhiệtđộ phịng sau khi khửtrùng. 400μl dịch huyền phù của 8 dòng vi khuẩnP. stutzeri ( giống cấp 1)được chủng vào bình vàủ ở
300C. Mẫuđược xác định mật sốvi khuẩn, ammonium, nitrit, nitrat trước và sau 24, 48, 72 giờ thí nghiệm.
Mỗi dịng vi khuẩn P. stutzeri được nuôi cấy độc lập với 3 lần lặp lại. Dùng
MINITAB 13 so sánh tốcđộ tăng trưởng, khả năng khửnitơtrung bình của 8 dịng vi khuẩn sau 24, 48, 72 giờ ni cấy.
3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hiệu suất khử nitơ trong nước thải chăn nuôiheo sau 24, 48, 72, 96, 144 giờ với 3 dòng vi khuẩn khử đạm P. stutzeri độc lập. heo sau 24, 48, 72, 96, 144 giờ với 3 dòng vi khuẩn khử đạm P. stutzeri độc lập. Thí nghiệm cũng thực hiện với sựphối hợp giữa các dòng P. stutzeri với nhau.
a.Địađiểm thí nghiệm
Trại chăn ni heo Nguyễn Trần Tường Bá, xã Song Bình, huyện Chợ Gạo, Tiền Giang.
b. Bốtrí thí nghiệm: Thí nghiệmđược bố trí thành 8 nghiệm thức.
Từ kết quả thí nghiệm trên, chọn lọc 3 dịng P. stutzeri có khả năng tăng trưởng nhanh và khử đạm cao. Tiến hành nhân sinh khối (giống cấp 2) trong 3 lít mơi trường BM/NO3-(1 lít/dịng). Mậtđộ vi khuẩnđạt tới >108vi khuẩn/mlđược sử dụng cho bố
trí thí nghiệm.
Nghiệm thức 0 (nghiệm thức đối chứng): mẫu nước thải chăn ni heo khơng có
cấy bổsung vi khuẩnP. stutzeri.
Nghiệm thức thí nghiệm 1: mẫu nước thải chăn ni heo có cấy vi khuẩnP. stutzeri
dòng chọn lọc 1 theo tỉ lệ 3‰ (v/v)4.
Nghiệm thức thí nghiệm 2: mẫu nước thải chăn ni heo có cấy vi khuẩnP. stutzeri
dịng chọn lọc 2 theo tỉ lệ 3‰ (v/v).
Nghiệm thức thí nghiệm 3: mẫu nước thải chăn ni heo có cấy vi khuẩnP. stutzeri
dòng chọn lọc 3 theo tỉ lệ 3‰ (v/v).
Nghiệm thức thí nghiệm 4: mẫu nước thải chăn ni heo có cấy 2 dịng vi khuẩnP. stutzeri theo tỉ lệ 1.5‰ (v/v) dòng chọn lọc 1 + 1.5‰ (v/v) dịng chọn lọc 2 .
Nghiệm thức thí nghiệm 5: mẫu nước thải chăn ni heo có cấy dịng 2 vi khuẩnP. stutzeri theo tỉ lệ 1.5‰ (v/v) dòng chọn lọc 1 + 1.5‰ (v/v) dịng chọn lọc 3.
Nghiệm thức thí nghiệm 6: mẫu nước thải chăn ni heo có cấy dòng 2 vi khuẩnP. stutzeri theo tỉ lệ 1.5‰ (v/v) dòng chọn lọc 2 + 1.5‰(v/v) dòng chọn 3.
Nghiệm thức thí nghiệm 7: mẫu nước thải chăn ni heo có cấy dịng 3 vi khuẩnP. stutzeri theo tỉ lệ 1‰ (v/v) dòng chọn lọc1 + 1‰(v/v) dòng chọn 2 + 1‰(v/v) dòng chọn lọc 3.
Nước thải sử dụng trong thí nghiệm này được lấy từao sinh học số 1. Tổng lượng nước thải sử dụng cho thí nghiệm là 1200 lít, được bố trí vào 24 đơn vị thí nghiệm (50 lít/đơn vị [thùng]) của 8 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các đơn vị thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên trong xơ nhựa 100 lít. Sụt khí
4Đơn vịtính: Thể tích/thể tích
trong 24 giờ. Sau đó để thống khí trong điều kiện tự nhiên. Định kỳ24, 48, 72, 96, 144 giờ lấy mẫuđể phân tích các chỉ tiêu pH, COD, N_NH4+, N_NO3-, N_NO2-.
Dùng MINITAB 13 để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 8 nghiệm thức. Sử dụng Microsoft Excel để vẽ đồthị.
3.2.2.4. Thí nghiệm 4: Thửnghiệm xử lý nước thải chăn ni heo
a.Địađiểm làm thí nghiệm
Trại chăn ni heo Nguyễn Trần Tường Bá, xã Song Bình, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Trại chăn ni trung bình khoảng 400 - 500 con, chất thải bao gồm rắn/lỏng cho vào hầm biogas hai ngăn có sức chứa 30 m3và 80 m3. Nước thải ra hầm biogas được đưa lần lượt vào các ao sinh học số 1, 2 và số 3 trước khi thải ra kênh, diện tích bề mặt mỗi ao sinh học khoảng 100 m2.
Sơ đồ vị trí các trại chăn ni heo và các ao sinh học ởtrại chăn nuôi heo của hộ Nguyễn Trần Tường Bá
Ghi chú: là hướng của dòng chảy nước thải
b. Bốtrí thí nghiệm
Trên kết quảphân tích từthí nghiệm 3, chọn lọc nghiệm thức phù hợpđểtiến hành cho thí nghiệm 4.
Thí nghiệmđược bốtrí thành 2 nghiệm thức, 3 lần lặp lại.
Nghiệm thức 1: Cho chế phẩm vi khuẩnP. stutzeri vào nước thải theo tỉ lệ 3‰.
Nghiệm thức 2: Nghiệm thứcđối chứng. Không bổsung vi khuẩn vào nước thải. Nước thải sử dụng trong thí nghiệm này được lấy từao sinh học số 3. Tổng lượng nước thải là 6.000 lít chia đều cho 6 đơn vịthí nghiệm của 2 nghiệm thức. Cácđơn vị
thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên trong bể chứa 1.200 lít. Để thống khí
Ao Sinh học số3 Ao Sinh học số2 Trại ni thịt 100 con Hầm Bio- gas 80 m3 Ao sinh học số1 Trại ni heo thịt 300 con Trại heo giống 100 con Hầm biogas 30 m3 Ao lắng Kê nh • •• • • ••• • •• • • •••• • •• • •• • • •• • • •• •• • ••••• • •• • • ••• • • • •• • • •• • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
trong điều kiện tự nhiên. Định kỳ 2, 4, 6 ngày lấy mẫu phân tích các chỉ tiêu pH, COD, N_NH4+, N_NO3-, N_NO2-, TN.
Phân tích LSD0.01, sử dụng Microsoft Excelđể vẽ đồthị.
3.2.3. Phương pháp xác định mật số vi khuẩn và các chỉtiêu hoá lý
a. Xác định mật số vi khuẩn (Phương pháp đếm gián tiếp) [Đếm sống nhỏ giọt (Drop Plate count)].
Dùng thủ thuật vô trùng cho khoảng 25 ml môi trường Minimal agar lỏng ở nhiệt
độ khoảng 450C vào đĩa petri. Để môi trường nguội dần trước khi sử dụng hay trữ trong tủ lạnh.
Pha loãng 1/10, 1/100, 1/1000 .... dung dịch chứa vi sinh vật bằng cách chuyển 1 ml của ống này sang ống kia chứa 9 ml nước cất đã khử trùng. Sau mỗi lần chuyển phải lắcđều trước khi chuyển lần thứ hai, vi sinh vật phân phốiđều trong ống.
Lắc đều các ống pha loãng, dùng pipet hút 10 μl và chuyển vào môi trường đặc
trong đĩa petri.
Mangđĩa vào cất trong tủ ủ. Quan sát kết quả sau 48 giờ hoặc 72 giờ ủ ở 300C.
Đếm số khuẩn lạc trung bình (skltb) ở mỗiđộpha loãng: Số vi khuẩn trong 1 ml mẫu = skltb * độpha lỗng * 102.
Hình 2: Phương phápđếm sống
b. Phân tích các chỉ tiêu pH, COD, N_NH4+
, N_NO3-, N_NO2-, TN
Mẫu được lấy, bảo quản lạnh, gởi kiễm mẫu ở Phịng thí nghiệm chuyên sâu – TrườngĐại học Cần Thơvà Trung Tâm Kỹ thuật và Công nghệ Sinh học Tiền Giang.
1/10 1/102 1/103