Cơng thức tính: Tính hàm lƣợng kim loại trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), theo công thức:
(2-2)
Trong đó:
C là nồng độ kim loại trong dung dịch thử, tính bằng miligam trên lít (mg/l);
C0 là nồng độ trung bình của kim loại trong dung dịch thử trắng, tính bằng miligam trên lít (mg/l);
V là thể tích của dung dịch thử, tính bằng mililit (ml); m là khối lƣợng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
2.4.3 Xác định hàm lượng iod bằng phương pháp quang phổ nguồn plasma
cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS)[27]
Cách tiến hành: Cân khoảng 100mg đến 500mg mẫu (tính theo chất khơ), chính xác đến 1mg, thêm 5ml nƣớc và trộn kỹ. Thêm 1ml dung dịch TMAH trộn kỹ, làm kín ình và đặt trong tủ sấy đã làm nóng trƣớc đến 90oC trong 3 giờ. Sau
Nguyên tố Ngọn lửa Bƣớc sóng (nm)
Fe Dinitơ monoxit-axetylen, oxy hóa 248,30
Cu Khơng khí-axetylen, oxy hóa 324,70
Zn Khơng khí-axetylen, oxy hóa 213,90
Mg Khơng khí-axetylen, oxy hóa 285,20
khi nguội, chuyển định lƣợng chứa sang ình định mức 25ml và pha loãng bằng nƣớc đến vạch. Lọc qua bộ lọc màng lỗ 0,45µm.
Sau khi thiết bị đã đƣợc hiệu chuẩn, tiến hành phân tích mẫu thử. Mỗi mẫu pha lỗng đƣợc lọc từ 5-10ml và phân tích bằng ICP-MS. Tốc độ đếm của các tín hiệu thử nghiệm giảm dần theo sự tăng tổng hàm lƣợng muối của dung dịch mẫu thử. Việc hiệu chỉnh hiệu ứng nền này bằng chất chuẩn nội sẽ hợp lý trong các trƣờng hợp nếu cƣờng độ của nó trong dung dịch mẫu khác với cƣờng độ trong các dung dịch hiệu chuẩn quá 30%.
Công thức tính:
(2-3)
Trong đó:
C: nồng độ mẫu (mg/ml, trong đó dung dịch mẫu đọc trên đƣờng cong); V: thể tích dịch chiết (ml);
d: hệ số pha loãng; W: khối lƣợng mẫu (g);
S: nồng độ mẫu của iod (µg/100g)
2.4.4 Xác định hàm lượng canxi, photpho bằng phương pháp quang phổ
nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS)
Cách tiến hành: Cân chính xác 1g mẫu thử, sấy khơ và nghiền cho vào chén sứ tráng men, dạng cao. Tro hóa 2 giờ ở 500°C và để nguội. Tro ƣớt với 10 giọt H2O và cẩn thận thêm 3-4 ml HNO3 (1:1). àm ay hơi HNO3 dƣ trên tấm nóng 100-120°C. Quay trở lại lị và tro hóa thêm 1 giờ ở 500°C. Làm nguội chén, hòa tan tro trong 10ml HCl (1:1) và chuyển định lƣợng sang ình định mức 50 ml. Pha lỗng đến thể tích bằng H2O. [26].
Xác định nguyên tố đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp quang phổ phát xạ plasma kết hợp tự cảm. Hiệu chuẩn của thiết bị đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng các tiêu chuẩn hiệu chuẩn đã iết. Sau khi hiệu chuẩn xong, các giải pháp kiểm tra có thể đƣợc phân tích.
Cơng thức tính: Tính nồng độ cho từng phần tử của từng dung dịch thử đã pha lỗng theo µg/ml.
(2-4)
Trong đó:
a: là hàm lƣợng nguyên tố Ca hoặc P trong mẫu, tƣơng ứng với cƣờng độ phát xạ đƣợc đo trên đồ thị chuẩn (ppm);
Vđm: là thể tích định mức của dung dịch đo phổ (ml); m: là khối lƣợng mẫu lấy để phân tích (g);
Fd: hệ số pha lỗng.
2.4.5 Xác định hàm lượng vitamin B1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC)
Cách tiến hành: Mẫu đƣợc đồng hóa và xử lý bằng enzyme. Mẫu thử đã xử lý bằng enzyme đƣợc ly tâm và lọc qua giấy lọc hoặc đầu lọc cỡ 0,45µm (nhằm loại bỏ các hợp chất gây nhiễu và bảo vệ cột HPLC). Tiến hành oxy hóa thiamin thành thiocrom. Dung dịch mẫu đƣợc ơm vào hệ thống HP C pha đảo. Bơm các thể tích giống nhau gồm dung dịch chuẩn, mẫu và mẫu trắng vào hệ thống HPLC. Nhận dạng thiocrom bằng so sánh thời gian lƣu của các pick riêng lẻ trong sắc ký đồ thu đƣợc từ dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn [28].
Tính kết quả: Sử dụng đƣờng chuẩn, tính khối lƣợng vitamin B1, biểu thị theo thiamin clorua hydroclorua, bằng mg/100g mẫu.
(2-5)
Trong đó:
Ats: là diện tích pick hoặc chiều cao pick của thiocrom thu đƣợc với dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích;
Ast: là diện tích pick hoặc chiều cao pick của thiocrom thu đƣợc với dung dịch thử chuẩn, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích;
Vts: là thể tích dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (ml);
ρ: là nồng độ khối lƣợng của thiamin clorua hydroclorua trong dung dịch chuẩn (µg/ml);
ms: là khối lƣợng mẫu, tính bằng gam (g); 100: là hộ số để tính hàm lƣợng trên 100g;
1000: là hệ số chuyển đổi µg/100g thành mg/100g;
Báo cáo kết quả vitamin B1 bằng mg/100g đƣợc biểu thị theo thiamin clorua hydroclorua (M=337,28).
2.4.6 Xác định hàm lượng vitamin B12 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC)
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử trong điều kiện tránh ánh sáng UV. Bảo quản mẫu thử đã chuẩn bị ở nhiệt độ từ 2oC đến 8oC và sử dụng trong vịng 14 ngày. Đồng hóa mẫu thử. Thêm 30ml dung dịch đệm natri acetat 0,1M và 1ml dung dịch kali xyanua 1%. Đun nóng mẫu ở nhiệt độ 105oC, 60 phút. Sau đó, lấy mẫu ra và làm nguội trong bể nƣớc đá. Cô đặc và làm sạch mẫu bằng cột SPE C18 loại 600mg. Sử dụng 44 ml axetonitril 25% vào các cột SPE 600mg để rửa giải vitamin B12. Sau đó dịch cơ đƣợc hịa tan trong nƣớc và đƣợc ơm vào máy HPLC. Với pha động D: Dung dịch axetonitril 2,5%, tốc độ dòng: 1,2 ml/phút;
điều chỉnh sao cho dịch rửa giải vitamin B12 chảy từ cột rây phân tử trong thời gian từ 10,5 phút đến 14,5 phút [29].
Tính kết quả: Tính phần khối lƣợng của vitamin B12 trong mẫu thử, X (µg/kg), theo cơng thức sau:
(2-6) Trong đó:
Ci: là nồng độ vitamin B12 trong dung dịch mẫu thử đƣợc ơm vào thiết bị HP C, đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn, tính bằng microgram trên lít (µg/l);
D1: là thể tích dung dịch pha lỗng thứ nhất, tính bằng mililit (D1=100ml); D2: là thể tích dung dịch pha lỗng cuối cùng, tính bằng mililit (ml);
V: là thể tích dịch lọc đƣợc đƣa lên cột SPE, tính bằng mililit (ml); w: là khối lƣợng mẫu, tính bằng gam (g).
2.4.7 Xác định hàm lượng vitamin A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Cách tiến hành: Khởi động hệ thống HPLC và cho phép làm nóng và cân bằng trong tối thiểu 30 phút với pha động di chuyển với tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút.Tiêm các vitamin chuẩn đã đƣợc thực hiện thơng qua xà phịng hóa vào hệ thống HPLC. Điều chỉnh pha động để đạt đƣợc độ phân giải 1,5 hoặc tốt hơn. Các pha A và B di động lần lƣợt là nƣớc/metanol (20:80) và metanol (100%), với cả hai pha di động bao gồm cả acid formic 0,1%. Các thông số khác bao gồm tốc độ dòng pha di động 0,25 đến 0,50 ml/phút, nhiệt độ cột 29°C, thể tích tiêm mẫu 5μl, năng lƣợng va chạm 21V, áp suất khí ion 50 psi, nhiệt độ ion hóa 320°C [30]. Cơng thức tính: Sử dụng tiêu chuẩn USP. Xác định yếu tố đáp ứng cho vitamin A (RFA):
(2-7)
Trong đó:
PkHTstd là chiều cao cực đại hoặc diện tích tiêu chuẩn từ sắc ký đồ; mlstd là ml của tiêu chuẩn làm việc đƣợc sử dụng trong thủ tục;
concstd sự cô đặc của USP vitamin A (dƣới dạng retinol) trên mỗi chứng nhận USP (mg/g);
mgstd là mg tiêu chuẩn USP đƣợc cân trong phần thuốc thử. 10000 các yếu tố pha loãng kết hợp cho tiêu chuẩn vitamin A.
Thêm chiều cao hoặc diện tích pick đã hiệu chỉnh cho đồng phân 13-cis với đồng phân all-trans để có tổng chiều cao hoặc diện tích của mẫu thử. Tính nồng độ vitamin A (tính bằng µg/g dƣới dạng retinol) theo phƣơng trình sau:
(2-8) Trong đó:
RFA: yếu tố ảnh hƣởng vitamin A;
PkHTSPLE: tổng chiều cao mẫu thử của diện tích hoặc diện tích của tất cả trans và 13-cis retinol;
100: khối lƣợng pha loãng của phần thử nghiệm, ml; W: trọng lƣợng của phần kiểm tra.
2.4.8 Xác định hàm lượng acid béo bằng phương pháp sắc ký khí (GC-MS)
Cân chính xác 100mg mẫu thử đã đồng nhất vào bình mojonnier có nhãn. Thêm 100mg acid pyrogallic và 2ml dung dịch chuẩn nội triglyceride, 2,0ml ethanol và trộn đều cho đến khi toàn bộ phần mẫu thử đồng nhất trong dung dịch. Thêm 10ml HCl 8,3M và trộn đều. Đặt bình vào rổ trong bể siêu âm ở 70-80oC đƣợc đặt ở tốc độ khuấy trộn vừa phải trong 40 phút. Thêm 25ml dietyl ete vào bình mojonnier. Đậy nắp ình và đặt trong máy ly tâm. y tâm 5 phút. Đổ lớp ether (trên cùng) dƣ lƣợng còn lại trong cốc chứa chất béo chiết xuất. Tiến hành methyl hóa.
Hịa tan dƣ lƣợng chất béo chiết xuất trong 2-3ml chloroform và 2-3ml dietyl ete. Cho ay hơi đến khô trong bể nƣớc 40oC. Thêm 2ml thuốc thử BF3 7% và 1ml toluene. Bịt kín lọ bằng nắp vặn có chứa vách ngăn ằng chất liệu teflon/silicone. Đặt lọ trong lò 45 phút ở 100oC. Lắc nhẹ lọ cứ sau 10 phút. Làm nguội sau đó thêm 5ml H2O, 1ml hexane và khoảng 1g Na2SO4. Đậy nắp lọ và lắc 1 phút đến khi có hiện tƣợng tách lớp, sau đó chuyển lớp trên cùng sang một lọ khác chứa 1g Na2SO4 ( ƣu ý: ớp trên cùng chứa FAME bao gồm FAME của dung dịch chuẩn triglyceride). Tiêm FAME vào lọ lấy mẫu tự động để phân tích GC.
Sử dụng dung dịch chuẩn FAME để tối ƣu hóa phản ứng sắc ký trƣớc khi tiêm mẫu. Sau khi tất cả các điều kiện sắc ký đã đƣợc tối ƣu hóa, tiêm dung dịch thử nghiệm [31].
Cơng thức tính:
Tính hệ số đáp ứng (Ri) cho mỗi acid béo i như sau:
(2-9) Trong đó:
Psi: diện tích pick của acid béo riêng trong dung dịch chuẩn FAME hỗn hợp;
PsC11:0: diện tích pick của acid béo C11:0 trong dung dịch chuẩn FAME hỗn
WC11:0: trọng lƣợng của chuẩn nội trong dung dịch chuẩn FAME hỗn hợp; Wi: trọng lƣợng của FAME cá nhân trong giải pháp tiêu chuẩn FAME hỗn hợp.
Tính lượng cá thể (triglyceride) (WTG) trong mẫu thử như sau:
(2-10) Trong đó:
Pti: diện tích cực đại của acid béo i trong phần thử nghiệm;
WtC11:0: trọng lƣợng của C11:0 tiêu chuẩn nội bộ đƣợc thêm vào phần thử
nghiệm (g);
1,0067: chuyển đổi tiêu chuẩn nội bộ từ triglyceride sang FAME;
PtC11:0: diện tích cực đại của C11:0 trong phần thử nghiệm;
ƒTGi: hệ số chuyển đổi cho FAME thành triglyceride cho từng acid béo riêng lẻ.
Tính tổng lượng chất béo trong mẫu thử (tổng của tất cả các acid béo; được biểu thị dưới dạng triglyceride (bao gồm cả dạng cis và trans của acid khơng bão hịa đơn) như sau:
(2-11) Trong đó: Wmẫu thử = khối lƣợng mẫu (g)
Tính trọng lượng của từng acid béo (Wi) như sau:
(2-12) ƒFai: các yếu tố chuyển đổi để chuyển đổi FAME thành các acid éo tƣơng ứng của chúng.
2.4.9 Xác định hàm lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành trên máy Agilent 1200 HPLC với ơm kép G1311A và detector G1315B Diode Array Detector (DAD), buồng chạy 10mm. Cài đặt DAD: UV: 338nm, 10nm bandwidth (bw), reference: 390nm, 20nm bw (cho các acid amin OPA) 262nm, 16nm bw, reference: 324nm, 8nm bw (cho các acid amin FMOC). Độ rộng peak: > 0,03 phút (0,5 giây). Slit: 4nm. Cột ZORBAX Eclipse-AAA 4,6 x 150mm (5µm) để đo với độ nhạy vừa phải, độ phân giải cao tại áp suất thấp.
Hỗn hợp để phân tích sắc ký bao gồm 17 acid amin từ hỗn hợp acid amin chuẩn 250 pmol/µl standard mix (PN: 5061-3331) và citrulline và 6 acid amin bổ sung, đƣợc hịa trộn tại nồng độ khoảng 250 pmol/µl. Hỗn hợp acid amin để dựng đƣờng chuẩn bao gồm 17 acid amin từ hỗn hợp chuẩn và 4 acid bổ sung, cùng với thành phần chuẩn norvaline và sarcosine (PN: 5062-2478) đƣợc pha ở các nồng độ xác định.
Cách tiến hành: Cân 1g mẫu cho vào bình tam giác cổ nhám, bổ sung 75ml HCl 6M chứa 0,1% phenol. Sau đó, đƣợc đƣa vào hệ thống khí agon để đuổi hết khí O2 trong vòng 10 phút. Tiếp theo, vặn chặt nắp, ủ ở 110oC trong 24 giờ. Dung dịch thủy phân đƣợc lọc và làm khơ bằng máy cơ quay. Sau đó cao chiết đƣợc hịa tan trong acid HCl loãng 0,01M đến 50ml. Dịch acid amin đƣợc ơm vào máy HP C theo chƣơng trình đã chọn trên.
2.4.10 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl
Nguyên tắc: Mẫu đƣợc phân hủy trong acid sulfuric với sự có mặt của chất xúc tác. Nitơ từ protein và một số thành phần khác đƣợc chuyển đổi thành amoni sunfate. Sản phẩm phân hủy đƣợc kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxyde và giải phóng amoniac bằng cách chƣng cất vào lƣợng dƣ dung dịch acid boric. Chuẩn độ amoniac bằng dung dịch chuẩn acid. Hàm lƣợng nitơ đƣợc tính từ lƣợng amoniac tạo thành. Kết quả đƣợc chuyển đổi thành "protein thô" bằng cách nhân với một yếu tố (thƣờng là 6,25) [32].
Cách tiến hành:
Cân 1g mẫu, chính xác đến 1mg, chuyển định lƣợng vào bình Kjeldahl khơ. Thêm 25ml acid sulfuric và 10g chất xúc tác, phân hủy trong tủ hút, cho vào chậm và xoay nhẹ ình để tránh tạo bọt q mức. Đun sơi hỗn hợp trong ít nhất 45 phút sau khi dịch phân hủy thành màu xanh nhạt rõ ràng. Để nguội dịch hoàn toàn và thêm 100-200ml nƣớc. Trộn và chuyển vào ình chƣng cất. Thêm 80-85ml dung dịch natri hydroxyde bão hòa.
Chƣng cất amoniac vào 25ml acid clohydric 0,1N có chứa vài giọt chỉ thị methyl red. Hoặc chƣng cất vào 50ml acid boric 2% có chứa chất chỉ thị bromocresol xanh. Acid boric là trung tính với chỉ thị này và amoni borat kiềm đƣợc tạo thành đƣợc chuẩn độ trực tiếp với HCl 0,1N. Chuẩn độ acid dƣ ằng NaOH 0,1N.
Cơng thức tính: (2-13) Trong đó:
V: là ml acid 0,1N đƣợc thêm vào - ml dung dịch NaOH 0,1N đƣợc sử dụng để trung hòa nitơ amoniac.
2.4.11 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme thích hợp so với nguyên liệu[8]
2.4.11.1 Khảo sát nồng độ enzyme và thời gian phản ứng.
Hỗn hợp phản ứng đƣợc chuẩn bị với 4,5 g vẹm xanh trong 100 ml Tris - hydrochloride 0,05 M (Tris-HCl, pH 7,0), tiến hành thủy phân với dãy nồng độ enzyme protease (0,5, 1,0, 1,5 và 2,0 mg / ml) ở nhiệt độ phòng (250C) trong ba khoảng thời gian (360, 488 và 600 phút). Dừng phản ứng thủy phân bằng cách bổ sung dung dịch TCA 10% theo tỉ lệ 1:1 trong 30 phút. Lớp dịch nổi phía trên có chứa dịch thủy phân đƣợc thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Để xác định lƣợng sản phẩm tạo thành, 2ml dịch thủy phân và 1ml dung dịch thuốc thử Folin & Ciocalteu 0,5M đƣợc trộn trong dung dịch natri cacbonat 0,5M rồi ủ ở 500C trong 30 phút. Sản phẩm thủy phân đƣợc đo ằng máy quang phổ ở ƣớc sóng 660 nm.
2.4.11.2 Khảo sát nồng độ cơ chất bột vẹm xanh.
Sau khi xác định đƣợc nồng độ enzyme và thời gian phản ứng tối ƣu, tiến hành khảo sát nồng độ cơ chất bột vẹm xanh bằng cách sử dụng dãy nồng độ cơ chất gồm 0.5, 1.5, 2.5, 3.5 và 4.5 g vẹm xanh trong Tris-HCl 0,05 M (pH 7,0). Phản ứng thủy phân đƣợc thực hiện với việc bổ sung 2 mg/ml protease cho mỗi ống phản ứng và đƣợc ủ ở 250C trong 600 phút. Sau khi ủ 600 phút, ngừng phản ứng thủy phân bằng cách bổ sung dung dịch TCA 10% theo tỉ lệ 1:1 trong 30 phút. Lớp dịch nổi phía trên có chứa dịch thủy phân đƣợc thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Để xác định lƣợng sản phẩm tạo thành, 2ml dịch thủy phân và 1ml dung dịch thuốc thử Folin & Ciocalteu 0,5M đƣợc trộn trong dung dịch natri cacbonat 0,5M rồi ủ ở 500C trong 30 phút. Sản phẩm thủy phân đƣợc đo ằng máy quang phổ ở ƣớc sóng 660 nm.
2.4.12 Phương pháp thủy phân protein bằng enzyme
Bột vẹm xanh đƣợc trộn vào trong dung dịch Tris-HCl (pH=7,0) để dịch vẹm xanh đạt nồng độ 45mg/ml. Enzym protease (60mg/ml) pha loãng đạt nồng độ 2mg/ml trong dung dịch Tris-HCl (pH=7,0). Bổ sung dung dịch enzyme pha loãng trên vào dịch vẹm xanh theo tỉ lệ 1:1. Thủy phân trong 10 giờ ở điều kiện 25oC đƣợc tính