4. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
2.4.11 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme thích hợp so với nguyên
2.4.11.1 Khảo sát nồng độ enzyme và thời gian phản ứng.
Hỗn hợp phản ứng đƣợc chuẩn bị với 4,5 g vẹm xanh trong 100 ml Tris - hydrochloride 0,05 M (Tris-HCl, pH 7,0), tiến hành thủy phân với dãy nồng độ enzyme protease (0,5, 1,0, 1,5 và 2,0 mg / ml) ở nhiệt độ phòng (250C) trong ba khoảng thời gian (360, 488 và 600 phút). Dừng phản ứng thủy phân bằng cách bổ sung dung dịch TCA 10% theo tỉ lệ 1:1 trong 30 phút. Lớp dịch nổi phía trên có chứa dịch thủy phân đƣợc thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Để xác định lƣợng sản phẩm tạo thành, 2ml dịch thủy phân và 1ml dung dịch thuốc thử Folin & Ciocalteu 0,5M đƣợc trộn trong dung dịch natri cacbonat 0,5M rồi ủ ở 500C trong 30 phút. Sản phẩm thủy phân đƣợc đo ằng máy quang phổ ở ƣớc sóng 660 nm.
2.4.11.2 Khảo sát nồng độ cơ chất bột vẹm xanh.
Sau khi xác định đƣợc nồng độ enzyme và thời gian phản ứng tối ƣu, tiến hành khảo sát nồng độ cơ chất bột vẹm xanh bằng cách sử dụng dãy nồng độ cơ chất gồm 0.5, 1.5, 2.5, 3.5 và 4.5 g vẹm xanh trong Tris-HCl 0,05 M (pH 7,0). Phản ứng thủy phân đƣợc thực hiện với việc bổ sung 2 mg/ml protease cho mỗi ống phản ứng và đƣợc ủ ở 250C trong 600 phút. Sau khi ủ 600 phút, ngừng phản ứng thủy phân bằng cách bổ sung dung dịch TCA 10% theo tỉ lệ 1:1 trong 30 phút. Lớp dịch nổi phía trên có chứa dịch thủy phân đƣợc thu bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Để xác định lƣợng sản phẩm tạo thành, 2ml dịch thủy phân và 1ml dung dịch thuốc thử Folin & Ciocalteu 0,5M đƣợc trộn trong dung dịch natri cacbonat 0,5M rồi ủ ở 500C trong 30 phút. Sản phẩm thủy phân đƣợc đo ằng máy quang phổ ở ƣớc sóng 660 nm.
2.4.12 Phương pháp thủy phân protein bằng enzyme
Bột vẹm xanh đƣợc trộn vào trong dung dịch Tris-HCl (pH=7,0) để dịch vẹm xanh đạt nồng độ 45mg/ml. Enzym protease (60mg/ml) pha loãng đạt nồng độ 2mg/ml trong dung dịch Tris-HCl (pH=7,0). Bổ sung dung dịch enzyme pha loãng trên vào dịch vẹm xanh theo tỉ lệ 1:1. Thủy phân trong 10 giờ ở điều kiện 25oC đƣợc tính tại thời điểm bổ sung enzyme. Ngừng phản ứng thủy phân bằng TCA 10% theo tỉ lệ 1:1 (enzyme + dịch vẹm xanh: TCA) trong 30 phút. Tiến hành ly tâm
13000rpm/phút trong 15 phút để loại bỏ tủa protein và enzyme cịn sót lại. Thu hồi dịch thủy phân, kết thúc quá trình thủy phân.
2.4.13 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lí trên Excel, đƣợc trình bày dạng Mean ± SE. Các thuật tốn thống kê Student's t-test đƣợc sử dụng để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng, với P < 0,05 đƣợc coi là sai khác có ý nghĩa thống kê.
Số liệu đƣợc phân tích bằng chƣơng trình Graph pad prism v8.0.2. Từ kết quả phân tích, xác định mức tối ƣu của các yếu tố cho sản lƣợng protein đạt cực đại.
2.4.14 Phương pháp bắt gốc tự do DPPH [50]
Phƣơng pháp ắt gốc tự do DPPH là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả ổn định. Phƣơng pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm an đầu.
Ngun tắc: Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc đánh ắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH, sự giảm màu đó sẽ đƣợc xác định bằng cách đo quang ở ƣớc sóng 517 nm (Viện dƣợc liệu, 2006; Wojdylo A. et al, 2007).
Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử: Cân 2,7mg DPPH cho vào ình định mức 25ml. Thêm 25ml MeOH, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm MeOH vào cho đủ 25ml. Để ổn định trong tối 30 phút, 4o
C.
2.4.15 Phương pháp bắt gốc tự do ABTS [50]
Khả năng ắt gốc tự do ABTS đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Re và cộng sự (1999).
Nguyên tắc: Cation ABTS++ [2,2’-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6- sulfonate] là một chất phát quang màu xanh, đƣợc đặc trƣng ở độ hấp thu λ=734
nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS++, các chất chống oxy-hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở ƣớc sóng 734nm so với mẫu đối chứng để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa. Khả năng ắt gốc tự do ABTS của một cao chiết (hoặc chất chống oxy hóa) ở nồng độ xác định đƣợc biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%).
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN CHƢƠNG 3
Xác định thành phần nguyên liệu 3.1
Tiến hành xác định kích thƣớc vẹm xanh sử dụng trong thí nghiệm bằng cách đo các thơng số chiều dài, chiều rộng và khối lƣợng. Nguyên liệu vẹm xanh sử dụng đƣợc xác định qua các thông số trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Kích thƣớc của vẹm xanh
3.1.1 Hàm lượng protein vẹm xanh
Nguyên liệu vẹm xanh có hàm lƣợng các acid amin cao, đáng chú ý là hàm lƣợng methionine của vẹm xanh (0,22mg/100g) là giữ nhiệm vụ đặc iệt trong đó là khả năng chuyển thành phân tử chứa lƣu huỳnh đảm nhiệm nhiều vai trò khác nhau, ao gồm ảo vệ các mơ, chỉnh sửa DNA và duy trì hoạt động của tế ào. Ngồi ra, methionine còn giữ một vai trị quan trọng khác trong q trình tạo ra các protein mới thay thế các protein cũ đã già hoặc bị hƣ hại. Điều này cho thấy khả năng của nguyên liệu vẹm xanh hỗ trợ tốt cho cơ thể tái tạo năng lƣợng và chống lại các tác động gây oxi hóa bên ngồi.
Ngồi ra, tổng acid amin thiết yếu (∑E = 3,92mg/100g), tổng các acid amin không thiết yếu (∑NE = 5,34mg/100g), và hàm lƣợng của từ loại acid amin trong vẹm xanh đƣợc xác định cụ thể trong bảng 3.2.
Kích thƣớc Vẹm xanh
Chiều dài (cm ± SD) 13,60 ± 0,23
Chiều rộng (cm± SD) 5,34 ± 0,41
Bảng 3.2 Hàm lƣợng protein của vẹm xanh Việt Nam
c: đơn vị tính là g/100g; ∑E: Tổng acid amin thiết yếu
Hàm lƣợng Hàm lƣợng acid amin Histidine 0,18c Arganine 0,67c Threonine 0,40c Valine 0,39c Methionine 0,22c Isoleucine 0,39c Leucine 0,61c Phenylalanine 0,36c Lysine 0,70c ∑E 3,92c Glutamic acid 1,35c Proline 0,42c Glycine 1,08c Alanine 0,52c Cystine 0,20c Aspartic acid 0,94c Tyrosine 0,38c Serine 0,45c Taurine - Citrulline - ∑NE 5,34c Tỉ lệ ∑E/∑NE 0,734 Hàm lƣợng Protein 11,40c
∑NE: Tổng acid amin không thiết yếu
Hàm lƣợng acid amin thiết yếu Lysin đạt 0,70g/100g nguyên liệu, acid amin không thiết yếu nhƣ Glycine chiếm hàm lƣợng 1,08g/100 trên tổng hàm lƣợng acid amin không thiết yếu là 5,34 g/100 g nguyên liệu an đầu.
3.1.2 Hàm lượng acid béo của vẹm xanh
Xác định hàm lƣợng acid béo của vẹm xanh ở Việt Nam điều đáng chú ý là chỉ tiêu hàm lƣợng omega 3, 6 và 9. Hàm lƣợng omega 3 có trong vẹm xanh (∑omega 3 = 491,5mg/100g), hàm lƣợng omega 6 của vẹm xanh (∑ omega 6 = 98,4mg/100g). Đối với hàm lƣợng omega 9 của vẹm xanh (∑ omega 9 = 45,3 mg/100g. Với hàm lƣợng omega 3,6,9 cao của vẹm xanh thì đây sẽ là một nguồn cung cấp các acid béo tốt cho cơ thể con ngƣời. Hàm lƣợng của các acid béo còn lại đƣợc xác định trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Hàm lƣợng acid béo vẹm xanh
Acid béo Hàm lƣợng (mg/100g) C14:0 154,00a C16:0 422,00a C16:1 170,00a C18:0 145,00a C18:1 18,70a C18:2 22,00a C18:3 61,50a C20:1 26,60a C20:4 76,40a C20:5 247,00a C22:1 156,00a a
a: đơn vị tính là mg/100g;
3.1.3 Thành phần khoáng chất, vitamin và kim loại của vẹm xanh Phú Yên
3.1.3.1 Thành phần khống chất
Tiến hành phân tích thành phần khống trên vẹm xanh ở Việt Nam tập trung vào các chỉ tiêu: hàm lƣợng kali, canxi, sắt, magie, kẽm, photpho, iod, đồng.
Vẹm xanh có tổng khống chất 496,847mg/100g thịt. Cụ thể, về hàm lƣợng kali, vẹm xanh (162mg/100g); hàm lƣợng sắt trong vẹm xanh (1,82mg/100g); magie có trong vẹm xanh (46,30mg/100g); hàm lƣợng đồng của vẹm (0.23mg/100g), hàm lƣợng kẽm có trong vẹm xanh (1,38mg/100g). Vẹm xanh có hàm lƣợng các chỉ tiêu về hàm lƣợng canxi, phốt-pho và iod cao. Cụ thể, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4 cho ta thấy rằng, hàm lƣợng canxi ở vẹm xanh (117mg/100g).
Bảng 3.4 Thành phần khống chất vẹm xanh a: đơn vị tính là mg/100g; a: đơn vị tính là mg/100g; b: đơn vị tính là µg/100g; Kim loại Hàm lƣợng Kali 162,00a Canxi 117,00a Sắt 1,82a Magie 46,30a Kẽm 1,38a Photpho 168,00a Iod 117,00b Đồng 0,23 a
3.1.3.2 Thành phần vitamin
Tiến hành phân tích thành phần vitamin trong vẹm xanh ở Việt Nam, so sánh giữa bốn chỉ tiêu đƣợc phát hiện gồm hàm lƣợng vitamin A, B1, B12 và D. Hàm lƣợng vitamin B1 không phát hiện trong vẹm xanh và hàm lƣợng vitamin D trong mẫu vẹm xanh (<48IU/100g). Đối với hàm lƣợng vitamin A vẹm xanh chứa 0,21mg/100g. Vẹm xanh chứa hàm lƣợng vitamin B12 (0,018mg/100g) cao.
Bảng 3.5 Thành phần vitamin vẹm xanh
b: đơn vị tính là µg/100g; d: đơn vị tính là mg/kg; e: đơn vị tính là IU/100g; 3.1.3.3 Kim loại nặng
Phân tích mức độ an tồn về kim loại nặng của vẹm xanh ở Việt Nam cho thấy hàm lƣợng chì ảnh hƣởng khơng đáng kể đến sức khỏe ngƣời trƣởng thành nhƣng có ảnh hƣởng đến sự phát triển thần kinh của bào thai, trẻ sơ sinh và trẻ em. Ngƣỡng kim loại chì cho phép tồn tại trong loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ tối đa ở 1,50 mg/kg[33]. Hàm lƣợng chì trong trong vẹm xanh 0,1mg/kg, đạt ngƣỡng an toàn theo yêu cầu của Bộ Y tế.
Vitamin Hàm lƣợng
Vitamin A 0,21e
Vitamin B1 -
Vitamin B12 0,018b
Kết quả xác định các thông số kỹ thuật 3.2
Bảng 3.6 Nồng độ enzyme và thời gian phản ứng
[E] mg/ml 360 phút 480 phút 600 phút 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0.482 0.531 0.402 0.544 0.6 0.567 0.568 0.574 0.538 1 0.61 0.523 0.429 0.588 0.62 0.537 0.707 0.644 0.598 1.5 0.514 0.573 0.506 0.621 0.718 0.65 0.738 0.637 0.623 2 0.523 0.537 0.569 0.691 0.64 0.567 0.661 0.613 0.651
Hình 3.1 Đồ thị sự tƣơng quan giữa nồng độ enzyme với thời gian phản ứng Nồng đồ bột vẹm Bảng 3.7 Nồng độ cơ chất bột vẹm [S] mg/ml OD 660nm 0 0 0 0 5 0.476 0.512 0.37 15 0.777 0.69 0.719 25 0.883 0.853 0.813 35 0.998 1.018 0.99 45 0.978 1.118 0.808
Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến q trình thủy phân đƣợc xác định thơng qua phản ứng thủy phân 4,5 g bột vẹm xanh với dãy nồng độ enzyme protease (0,5, 1,0, 1,5, 2,0 mg/ml) ở 250C trong ba khoảng thời gian khác nhau (360, 480 và 600 phút). Kết quả cho thấy nồng độ enzyme càng cao và thời gian phản ứng càng kéo dài tạo ra số lƣợng sản phẩm nhiều hơn, trong đó nồng độ enzyme 2 mg/ml cho số lƣợng sản phẩm đạt mức tối đa (Bảng 3.6). Trong thời gian phản ứng 480 và 600 phút, tốc độ sản phẩm tạo ra tăng dần và khơng có nhiều sự khác biệt, ngƣợc lại tốc độ tạo sản phẩm ở 360 phút thì thấp hơn. Hơn nữa, cả ba thử nghiệm về thời gian phản ứng thủy phân đều đạt đến trạng thái cân bằng ở nồng độ enzyme 2 mg/ml, do đó thời gian thủy phân tối ƣu xác định của bột vẹm xanh là 600 phút và nồng độ enzyme tối ƣu là 2 mg/ml.
Ảnh hƣởng của năm nồng độ bột vẹm xanh từ 5 đến 45 mg đã đƣợc tiến hành khảo sát trong cùng điều kiện enzyme protease 2 mg/ml với thời gian phản ứng 600 phút, cho thấy ở nồng độ 45 mg/ml là tối ƣu do sản phẩm thủy phân tạo ra với hàm lƣợng cao nhất so với các nồng độ cơ chất khác (Bảng 3.7). Từ những kết quả khảo sát trên, điều kiện thủy phân bột vẹm xanh tối ƣu đƣợc xác định nồng độ cơ chất vẹm xanh là 45 mg/ml, nồng độ enzyme protease sử dụng là 2 mg/ml, phản ứng thủy phân đƣợc thực hiện trong 600 phút, pH 7.0 và ở 250C.
Quy trình cơng nghệ thủy phân vẹm xanh bằng enzym protease 3.3
3.3.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ 10ml Đánh giá khả năng kháng oxy hóa (DPPH và ABTS). Đánh giá khả năng kháng oxy hóa (DPPH và ABTS). Bột vẹm xanh 45mg/ml Enzym protease 2mg/ml 10ml Thủy phân (10 giờ, 25oC)
Đệm Tris-HCl (pH =7.0) Ngừng phản ứng bằng TCA 10% (20ml) Ly tâm 13000 rpm/phút 30 phút 15 phút
Thu hồi dịch thủy phân
Đánh giá khả năng kháng oxy hóa (DPPH và ABTS).
Sấy phun Đơng khơ
3.2.2 Thuyết minh quy trình
Trƣớc khi tiến hành thủy phân, các thiết bị và dụng cụ dùng trong thủy phân cần phải đƣợc rửa sạch bằng xà phòng, tráng bằng cồn và đƣợc khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
Bƣớc 1: Tiến hành thủy phân
Bột vẹm xanh đƣợc trộn với dung dịch Tris-HCl 0.05M để đạt nồng độ 45mg/ml. Enzym protease (60mg/ml) pha loãng xuống nồng độ 2mg/ml (pha loãng bằng Tris-HCl pH =7,0). Bổ sung enzym protease (2mg/ml) vào hỗn hợp vẹm xanh (45mg/ml) theo tỉ lệ 1:1.
Tiến hành thủy phân trong 10 giờ ở nhiệt độ 25oC. Bƣớc 2: Ngừng phản ứng thủy phân
Sau khi thủy phân 10 giờ, TCA 10% đƣợc bổ sung vào dịch để ngừng phản ứng thủy phân trong 30 phút theo tỷ lệ 1:1 ( dịch vẹm xanh + enzym protease : TCA 10%).
Bƣớc 3: Ly tâm
Sau khi ngừng phản ứng thủy phân bằng TCA 10%, tiến hành ly tâm 13000 rpm/phút trong 15 phút.
Bƣớc 4: Thu hồi dịch thủy phân và tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa ở các điều kiện khác nhau.
Sau khi thu hồi dịch thủy phân, chia dịch thủy phân thành 3 phần: + Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân.
+ Tiến hành đông khô sau đó test khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân. + Tiến hành sấy phun sau đó test khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân.
3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi sản phẩm
Để tính hiệu suất, mẫu vẹm xanh đƣợc thủy phân, sau đó ly tâm lấy dịch, sấy phun và đông khô nhằm thu lại khối lƣợng chất tan. Kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.8 Khối lƣợng trƣớc và sau khi sử dụng phƣơng pháp sấy phun và đông khơ
Hiệu suất thu hồi sản phẩm đƣợc trình bày ở bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi sản phẩm của phƣơng pháp sấy phun cao hơn khoảng 3 lần so với phƣơng pháp đông khô. Từ kết quả trên cho thấy, phƣơng pháp sấy phun có khả năng giữ lại đƣợc nhiều chất tan hơn phƣơng pháp đông khô.
3.3.3 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân vẹm xanh
3.3.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Tiến hành:
(Khi cho DPPH 0,1mM vào thì lắc rồi đậy kín bằng giấy bạc).
Để ở nhiệt độ phịng trong 30 phút. Tiến hành đo quang ở ƣớc sóng 517nm. Tính kết quả
Hoạt tính đánh ắt gốc tự do HTCO (%) đƣợc tính theo cơng thức:
Phƣơng pháp Khối lƣợng ban đầu
Khối lƣợng sau phƣơng pháp
Hiệu suất thu hồi (%) Sấy phun 100 9,45 9,45 Đông khô 100 3,89 3,89 Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Dịch thủy phân (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Tris-HCl (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 DPPH (ml) 2 2 2 2 2 2
HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ ODchứng ] x 100 (3-1)
Các số liệu kết quả thử nghiệm đƣợc biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo độc lập khác nhau. Cùng với vitamin C, cho kết quả HTCO (%) cao nhất, tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn tính đƣợc IC50. Giá trị IC50 càng thấp thì HTCO càng cao và ngƣợc lại.
Cách tính IC50: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả năng dập tắt gốc tự do theo nồng độ khảo sát của thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, suy ra giá trị nồng độ dập tắt gốc tự do IC50 bằng cách thay y = 50.
Bảng 3.9 Kết quả đo OD của dịch thủy phân theo phƣơng pháp DPPH.
Khả năng ắt gốc tự do của mẫu:
Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Lần 1 0,721 0,378 0,265 0,230 0,179 0,147 Lần 2 0,727 0,377 0,276 0,234 0,186 0,146 Lần 3 0,725 0,379 0,279 0,231 0,179 0,142 Trung bình 0,724 0,378 0,273 0,232 0,181 0,145 % Bắt gốc tự do trung bình 0,00 47,81 62,26 68,02 74,79 79,98
Kết quả Biểu đồ
DPPH
(%) 79.98%
Hình 3.3 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh theo phƣơng pháp DPPH.
IC50 của dịch thủy phân: 77,05 Giá trị IC50 = 10,56 (mg/ml).
Bảng 3.10 Kết quả đo OD của Vitamin C
Nồng độ VitC (µg/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 OD 0,768 0,645 0,539 0,441 0,327 0,21 0,115 0,021