b: đơn vị tính là µg/100g; d: đơn vị tính là mg/kg; e: đơn vị tính là IU/100g; 3.1.3.3 Kim loại nặng
Phân tích mức độ an toàn về kim loại nặng của vẹm xanh ở Việt Nam cho thấy hàm lƣợng chì ảnh hƣởng khơng đáng kể đến sức khỏe ngƣời trƣởng thành nhƣng có ảnh hƣởng đến sự phát triển thần kinh của bào thai, trẻ sơ sinh và trẻ em. Ngƣỡng kim loại chì cho phép tồn tại trong loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ tối đa ở 1,50 mg/kg[33]. Hàm lƣợng chì trong trong vẹm xanh 0,1mg/kg, đạt ngƣỡng an toàn theo yêu cầu của Bộ Y tế.
Vitamin Hàm lƣợng
Vitamin A 0,21e
Vitamin B1 -
Vitamin B12 0,018b
Kết quả xác định các thông số kỹ thuật 3.2
Bảng 3.6 Nồng độ enzyme và thời gian phản ứng
[E] mg/ml 360 phút 480 phút 600 phút 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0.482 0.531 0.402 0.544 0.6 0.567 0.568 0.574 0.538 1 0.61 0.523 0.429 0.588 0.62 0.537 0.707 0.644 0.598 1.5 0.514 0.573 0.506 0.621 0.718 0.65 0.738 0.637 0.623 2 0.523 0.537 0.569 0.691 0.64 0.567 0.661 0.613 0.651
Hình 3.1 Đồ thị sự tƣơng quan giữa nồng độ enzyme với thời gian phản ứng Nồng đồ bột vẹm Bảng 3.7 Nồng độ cơ chất bột vẹm [S] mg/ml OD 660nm 0 0 0 0 5 0.476 0.512 0.37 15 0.777 0.69 0.719 25 0.883 0.853 0.813 35 0.998 1.018 0.99 45 0.978 1.118 0.808
Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân đƣợc xác định thông qua phản ứng thủy phân 4,5 g bột vẹm xanh với dãy nồng độ enzyme protease (0,5, 1,0, 1,5, 2,0 mg/ml) ở 250C trong ba khoảng thời gian khác nhau (360, 480 và 600 phút). Kết quả cho thấy nồng độ enzyme càng cao và thời gian phản ứng càng kéo dài tạo ra số lƣợng sản phẩm nhiều hơn, trong đó nồng độ enzyme 2 mg/ml cho số lƣợng sản phẩm đạt mức tối đa (Bảng 3.6). Trong thời gian phản ứng 480 và 600 phút, tốc độ sản phẩm tạo ra tăng dần và khơng có nhiều sự khác biệt, ngƣợc lại tốc độ tạo sản phẩm ở 360 phút thì thấp hơn. Hơn nữa, cả ba thử nghiệm về thời gian phản ứng thủy phân đều đạt đến trạng thái cân bằng ở nồng độ enzyme 2 mg/ml, do đó thời gian thủy phân tối ƣu xác định của bột vẹm xanh là 600 phút và nồng độ enzyme tối ƣu là 2 mg/ml.
Ảnh hƣởng của năm nồng độ bột vẹm xanh từ 5 đến 45 mg đã đƣợc tiến hành khảo sát trong cùng điều kiện enzyme protease 2 mg/ml với thời gian phản ứng 600 phút, cho thấy ở nồng độ 45 mg/ml là tối ƣu do sản phẩm thủy phân tạo ra với hàm lƣợng cao nhất so với các nồng độ cơ chất khác (Bảng 3.7). Từ những kết quả khảo sát trên, điều kiện thủy phân bột vẹm xanh tối ƣu đƣợc xác định nồng độ cơ chất vẹm xanh là 45 mg/ml, nồng độ enzyme protease sử dụng là 2 mg/ml, phản ứng thủy phân đƣợc thực hiện trong 600 phút, pH 7.0 và ở 250C.
Quy trình cơng nghệ thủy phân vẹm xanh bằng enzym protease 3.3
3.3.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ 10ml Đánh giá khả năng kháng oxy hóa (DPPH và ABTS). Đánh giá khả năng kháng oxy hóa (DPPH và ABTS). Bột vẹm xanh 45mg/ml Enzym protease 2mg/ml 10ml Thủy phân (10 giờ, 25oC)
Đệm Tris-HCl (pH =7.0) Ngừng phản ứng bằng TCA 10% (20ml) Ly tâm 13000 rpm/phút 30 phút 15 phút
Thu hồi dịch thủy phân
Đánh giá khả năng kháng oxy hóa (DPPH và ABTS).
Sấy phun Đơng khơ
3.2.2 Thuyết minh quy trình
Trƣớc khi tiến hành thủy phân, các thiết bị và dụng cụ dùng trong thủy phân cần phải đƣợc rửa sạch bằng xà phòng, tráng bằng cồn và đƣợc khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
Bƣớc 1: Tiến hành thủy phân
Bột vẹm xanh đƣợc trộn với dung dịch Tris-HCl 0.05M để đạt nồng độ 45mg/ml. Enzym protease (60mg/ml) pha loãng xuống nồng độ 2mg/ml (pha loãng bằng Tris-HCl pH =7,0). Bổ sung enzym protease (2mg/ml) vào hỗn hợp vẹm xanh (45mg/ml) theo tỉ lệ 1:1.
Tiến hành thủy phân trong 10 giờ ở nhiệt độ 25oC. Bƣớc 2: Ngừng phản ứng thủy phân
Sau khi thủy phân 10 giờ, TCA 10% đƣợc bổ sung vào dịch để ngừng phản ứng thủy phân trong 30 phút theo tỷ lệ 1:1 ( dịch vẹm xanh + enzym protease : TCA 10%).
Bƣớc 3: Ly tâm
Sau khi ngừng phản ứng thủy phân bằng TCA 10%, tiến hành ly tâm 13000 rpm/phút trong 15 phút.
Bƣớc 4: Thu hồi dịch thủy phân và tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa ở các điều kiện khác nhau.
Sau khi thu hồi dịch thủy phân, chia dịch thủy phân thành 3 phần: + Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân.
+ Tiến hành đơng khơ sau đó test khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân. + Tiến hành sấy phun sau đó test khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân.
3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi sản phẩm
Để tính hiệu suất, mẫu vẹm xanh đƣợc thủy phân, sau đó ly tâm lấy dịch, sấy phun và đơng khơ nhằm thu lại khối lƣợng chất tan. Kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.8 Khối lƣợng trƣớc và sau khi sử dụng phƣơng pháp sấy phun và đông khô
Hiệu suất thu hồi sản phẩm đƣợc trình bày ở bảng 3.8. Hiệu suất thu hồi sản phẩm của phƣơng pháp sấy phun cao hơn khoảng 3 lần so với phƣơng pháp đông khô. Từ kết quả trên cho thấy, phƣơng pháp sấy phun có khả năng giữ lại đƣợc nhiều chất tan hơn phƣơng pháp đông khô.
3.3.3 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân vẹm xanh
3.3.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Tiến hành:
(Khi cho DPPH 0,1mM vào thì lắc rồi đậy kín bằng giấy bạc).
Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Tiến hành đo quang ở ƣớc sóng 517nm. Tính kết quả
Hoạt tính đánh ắt gốc tự do HTCO (%) đƣợc tính theo cơng thức:
Phƣơng pháp Khối lƣợng ban đầu
Khối lƣợng sau phƣơng pháp
Hiệu suất thu hồi (%) Sấy phun 100 9,45 9,45 Đông khô 100 3,89 3,89 Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Dịch thủy phân (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Tris-HCl (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 DPPH (ml) 2 2 2 2 2 2
HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ ODchứng ] x 100 (3-1)
Các số liệu kết quả thử nghiệm đƣợc biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo độc lập khác nhau. Cùng với vitamin C, cho kết quả HTCO (%) cao nhất, tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn tính đƣợc IC50. Giá trị IC50 càng thấp thì HTCO càng cao và ngƣợc lại.
Cách tính IC50: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả năng dập tắt gốc tự do theo nồng độ khảo sát của thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, suy ra giá trị nồng độ dập tắt gốc tự do IC50 bằng cách thay y = 50.
Bảng 3.9 Kết quả đo OD của dịch thủy phân theo phƣơng pháp DPPH.
Khả năng ắt gốc tự do của mẫu:
Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Lần 1 0,721 0,378 0,265 0,230 0,179 0,147 Lần 2 0,727 0,377 0,276 0,234 0,186 0,146 Lần 3 0,725 0,379 0,279 0,231 0,179 0,142 Trung bình 0,724 0,378 0,273 0,232 0,181 0,145 % Bắt gốc tự do trung bình 0,00 47,81 62,26 68,02 74,79 79,98
Kết quả Biểu đồ
DPPH
(%) 79.98%
Hình 3.3 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh theo phƣơng pháp DPPH.
IC50 của dịch thủy phân: 77,05 Giá trị IC50 = 10,56 (mg/ml).
Bảng 3.10 Kết quả đo OD của Vitamin C
Nồng độ VitC (µg/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 OD 0,768 0,645 0,539 0,441 0,327 0,21 0,115 0,021 % Bắt gốc tự do 0 16,015 29,818 42,578 57,422 72,656 85,026 97,265
Cân 0,034g K2S2O8 định mức lên 50ml bằng nƣớc cất (2,6mM). Trộn ABTS : K2S2O8 = 1 : 1.
Để hỗn hợp qua đêm ( > 18 giờ ở nhiệt độ phòng )
Thử nghiệm ABTS : Pha loãng ABTS bằng nƣớc cất cho đến khi đạt giá trị
OD734nm = 0,7 0,02. Tiến hành: Nồng độ (mg/ml) Trắng 0 9 18 27 36 45 Dịch thủy phân (ml) 0,1 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 ABTS (ml) 0 3 3 3 3 3 3 Nƣớc cất (ml) 3 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
Bảng 3.12 Kết quả đo OD của dịch thủy phân vẹm xanh
Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Lần 1 0,674 0,508 0,350 0,241 0,138 0,12 Lần 2 0,615 0,46 0,316 0,233 0,173 0,126 Lần 3 0,676 0,440 0,316 0,231 0,157 0,114 Trung bình 0,655 0,469 0,327 0,235 0,171 0,120 % Độ giảm độ hấp thu 0,00 28,35 50,03 64,12 73,89 81,68
ABTS
(%) 81.68%
Hình 3.5 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh theo phƣơng pháp ATBS .
IC50 của dịch thủy phân: 99,11 Giá trị IC50 = 18,31 (mg/ml).
Bảng 3.13 Kết quả đo % HTCO của Vitamin C.
Nồng độ VitC (µg/ml) L1 L2 L3 Trung bình 5 13,33 14,31 13,84 13,827 10 25,78 25,66 25,45 25,630 15 39,26 39,09 41,52 39,957 20 55,7 56,05 55,51 55,753 25 70,37 68,14 69,49 69,333 30 80,59 82,45 82,14 81,727
Hình 3.6 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ vitamin C Theo hình 3.6 ta thấy vitamin C ở nồng độ 30g/ml khả năng ắt gốc tự do trung Theo hình 3.6 ta thấy vitamin C ở nồng độ 30g/ml khả năng ắt gốc tự do trung bình 3 lần đo là cao nhất đạt 81,727 %.
3.3.3.3 So sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH và ATBS của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
a) So sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
Bảng 3.14 So sánh khả năng ắt gốc tự do DPPH của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với vitamin C
Nhận xét: Giá trị IC50 đƣợc định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. Giá trị IC50 càng nhỏ thì mẫu có hoạt tính càng cao[36].
Phƣơng trình hồi quy IC50 ( 𝐦𝐠 𝐦𝐥 )
Dịch thủy phân vẹm Y e X 5 10,56
Dựa vào Bảng 3.14 ta thấy rằng, giá trị IC50 của dịch thủy phân ( IC50 = 10,56 ) lớn hơn rất nhiều so với mẫu chuẩn là vitamin C ( IC50 = 0,01373 ), gấp 769 lần. Từ đó, minh chứng đƣợc rằng mẫu dịch thủy phân bột vẹm xanh có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH thấp hơn nhiều so với vitamin C.
b) So sánh khả năng bắt gốc tự do ABTS của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
Bảng 3.15. So sánh khả năng ắt gốc tự do ABTS của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
Dựa vào Bảng 3.15 ta thấy rằng, giá trị IC50 của dịch thủy phân (IC50 = 18,31) lớn hơn rất nhiều so với mẫu chuẩn là vitamin C (IC50 = 0,0183), gấp 1000 lần. Từ đó, minh chứng đƣợc rằng mẫu dịch thủy phân bột vẹm xanh có hoạt tính bắt gốc tự do ATBS thấp hơn nhiều so với vitamin C.
Nhận xét: Về nguyên tắc, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại ƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của mẫu. Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, chúng tơi xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính, từ đó chúng tơi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó ắt 50% gốc tự do DPPH) để làm cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa mẫu Vẹm xanh và Vitamin C. Mẫu Vẹm xanh có giá trị IC50 cao hơn Vitamin C vì vậy mẫu có khả năng ắt gốc tự do DPPH thấp hơn so với Vitamin C ( IC50 vẹm xanh: 10,56 > IC50 vitamin C: 3,49×10-3).
Phƣơng trình hồi quy IC50 ( 𝐦𝐠 𝐦𝐥 )
Dịch thủy phân
vẹm Y e X 18,31
Vitamin C Y= 2,759 X - 0,5015
Tƣơng tự, dịch thủy phân bột vẹm xanh cũng có hoạt tính bắt gốc tự do ATBS cao hơn nhiều so với vitamin C (IC50 dịch thủy phân:18.31 mg/ml > IC50 vitamin C: 0.0183 mg/ml).
Đông khô và sấy phun dịch thủy phân vẹm xanh bằng enzym protease 3.4
và thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của chúng bằng phƣơng pháp DPPH và ABTS
3.4.1 Quy trình đơng khơ dịch thủy phân vẹm xanh bằng enzym protease
[42]
Dịch thủy phân
Tiền đóng ăng (cấp đơng)
Sấy sơ cấp (thăng hoa)
Sấy thứ cấp (hấp phụ) Dịch 100ml to= -50oC (loại ỏ 95% độ ẩm) (loại ỏ 1-5% độ ẩm còn lại)
3.4.2 Quy trình sấy phun dịch thủy phân vẹm xanh bằng enzym protease
3.4.3 Đánh giá khả năng chống oxy hố của dịch thuỷ phân vẹm xanh sau
đơng khơ
3.5.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa dịch thủy phân vẹm xanh sau đông khô bằng phương pháp DPPH Chuẩn bị mẫu: Nồng độ mẫu(mg/ml) 0,05 0,1 0,15 0,2 2,5 Dịch thủy phân (ml) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 Nƣớc cất (ml) 0,49 0,48 0,47 0,46 0,45 DPPH (ml) 2 2 2 2 2
(Khi cho DPPH 0,1 mM vào các mẫu thì đậy kín bằng giấy bạc). Dịch thủy phân 130ml ọc 3 lần 100ml dịch Sấy phun Hỗn hợp ột tođầu vào = 170oC. tođầu ra = 91oC. T = 30 phút. Maltodextrin 20,8g (16% lƣợng dịch)
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau khi phản ứng, tiến hành đo quang ở ƣớc sóng λ = 517 nm.
Bảng 3.6 Kết quả đo OD của mẫu vẹm xanh sau đơng khơ ằng phƣơng pháp DPPH.
Hình 3.9 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh sau đông khô.
Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Lần 1 0,76 0,548 0,487 0,263 0,222 0,203 Lần 2 0,784 0,506 0,36 0,273 0,227 0,174 Lần 3 0,796 0,549 0,361 0,289 0,24 0,155 Trung bình 0,78 0,534 0,403 0,275 0,23 0,177 % Bắt gốc tự do 0 31,538 48,333 64,743 70,513 77,308
IC50 của mẫu vẹm xanh sau đông khô theo phƣơng pháp DPPH. Y e X
Giá trị IC50 = 0,996 (mg/ml).
3.4.3.2 Đánh giá khả năng chống oxy hóa dịch thủy phân vẹm xanh sau đông khô bằng phương pháp ABTS Chuẩn bị mẫu: Nồng độ mẫu(mg/ml) Trắng 0 5 10 15 20 25 Dịch ( l) 100 0 20 40 60 80 100 Nƣớc cất ( l) 3000 100 80 60 40 20 0 ABTS ( l) 0 3000 3000 3000 3000 3000 3000
Để nhiệt độ phòng trong 6 phút. Tiến hành đo quang ở ƣớc sóng λ = 734 nm. Bảng 3.7 Kết quả đo OD của mẫu vẹm xanh sau đông khô ằng phƣơng pháp
ABTS Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 5 10 15 20 25 Lần 1 0,682 0,395 0,308 0,151 0,117 0,035 Lần 2 0,672 0,361 0,24 0,161 0,121 0,024 Lần 3 0,677 0,358 0,26 0,152 0,126 0,033 Trung bình 0,677 0,371 0,269 0,155 0,121 0,031 % Bắt gốc tự do 0 45,199 60,266 77,105 82,127 95,421
Hình 3. 10 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh sau đông khô.
IC50 của mẫu vẹm xanh sau đông khô theo phƣơng pháp ABTS. ABTS: Y e X
Giá trị IC50 = 6,834 (mg/ml).
3.4.4 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân vẹm xanh sau sấy
phun
3.4.4.2 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân vẹm xanh sau sấy phun bằng DPPH Chuẩn bị mẫu Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 2,5 5 7,5 10 12,5 Dịch thủy phân (ml) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Nƣớc cất (ml) 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 DPPH (ml) 2 2 2 2 2 2
Bảng 3.8 Kết quả đo OD của mẫu vẹm xanh sau sấy phun.
Hình 3.1 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh sau sấy phun.
IC50 của mẫu vẹm xanh sau sấy phun theo phƣơng pháp DPPH. DPPH: Y e X Giá trị IC50 = 5,189 (mg/ml). Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 2,5 5 7,5 10 12,5 Lần 1 0,798 0,616 0,353 0,28 0,201 0,167 Lần 2 0,824 0,568 0,403 0,264 0,215 0,182 Lần 3 0,807 0,644 0,469 0,285 0,219 0,133 Trung bình 0,81 0,609 0,408 0,276 0,212 0,161 % Bắt gốc tự do 0 24,815 49,629 65,926 73,827 80,123
3.4.4.3 Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân vẹm xanh sau sấy phun bằng ABTS. Chuẩn bị mẫu. Nồng độ mẫu (mg/ml) 0 2,5 5 7,5 10 12,5 Dịch ( l) 0 10 20 30 40 50 Nƣớc cất ( l) 100 90 80 70 60 50 ABTS ( l) 3000 3000 3000 3000 3000 3000 Mẫu Trắng Nồng độ mẫu (mg/ml) 2,5 5 7,5 10 12,5 Dịch ( l) 10 20 30 40 50 Nƣớc cất 3090 3080 3070 3060 3050
Bảng 3.19 Kết quả đo OD của mẫu vẹm xanh sau sấy phun
Hình 3.2 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh sau sấy phun.
IC50 của mẫu vẹm xanh sau sấy phun theo phƣơng pháp ABTS.