Hình 3 .5 Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,67
Hình 3.9 Ảnh SEM của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
với các lƣợng BCP khác nhau
Ảnh SEM đƣợc sử dụng để khảo sát hình thái học của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau. Kết quả cho thấy hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP có cấu trúc khơng gian ba chiều xốp. Trong khi vật liệu đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp đúc khơng có cấu trúc xốp nhƣ hydrogel [79-82].
Cấu trúc không gian 3 chiều, xốp của hydrogel alginate oxi hóa -gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa -gelatin/BCP tạo khoảng cƣ trú cho tế bào dịch chuyển và lƣu thông các yếu tố chuyển hóa tạo xƣơng. Ngoài ra, tế bào và mạch máu có thể phát triển bên trong các lỗ xốp của vật liệu giúp xƣơng phát triển bên trong vật liệu [83, 84]. Do đó, cấu trúc xốp của hydrogel và hydrogel composite phù hợp cho ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng.
Phân tích cấu trúc pha của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Hình 3.10: Giản đồ XRD của hydrogel alginate oxi hóa và hydrogel
composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP A (77%HAp: 23% β-TCP); B ((66%HAp: 34% β-TCP); C ((21% HAp: 79% β-TCP)
Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X đƣợc dùng để phân tích thành phần pha của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa- gelatin/BCP. Giản đồ nhiễu xạ tia X của hydrogal composite ngồi sự xuất hiện các tín hiệu của tinh thể gelatin, alginate cịn xuất hiện các tín hiệu của HAp 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411).
Hình 3.11: Phổ FTIR cuả gelatin, alginate oxi hóa, hydrogel alginate oxi hóa-
gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Phƣơng pháp phân tích FTIR dùng để xác định cấu trúc của hydrogel và hydrogel composite dựa trên dao động của các liên kết. Phổ FTIR của alginate oxi hóa xuất hiện các dao động đặc trƣng của polysaccharide 1316 cm (C–O), 1116 cm (C–C), 1025 cm (C–O–C) và 948 cm (C–O) [85, 86]. Dao động 1617 and 1416 cm là dao động của nhóm carboxylate trên alginate [87]. Phổ FTIR của gelatin thể hiện các dao động đặc trƣng của cấu trúc protein nhƣ dao động tại 1636 and 1550 cm là dao động của nhóm N–H [88, 89].
Phổ FTIR của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin có những dao động của alginate oxi hóa, gelatin và dao động của nhóm C=N tại 1648 và 1545 do phản ứng Schiff's base của alginate oxi hóa và gelatin [90, 91]. Phổ FTIR của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP ngồi những dao động của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin cón xuất hiện dao động của PO43- tại 473, 567, 603, 962 and 1037 cm-1.
Nội dung 2: Vô trùng vật liệu
Vô trùng là tiêu diệt tất cả các loài vi sinh vật kể cả dạng sinh dƣỡng và bào tử, các nang ký sinh trùng và các siêu vi trùng. Sử dụng phƣơng pháp chiếu xạ gamma để vô trùng vật liệu (phụ lục 3).
Hiệu lực của quá trình khử trùng dụng cụ y tế bằng chiếu xạ đƣợc đánh giá dựa trên tài liệu ISO- 11137. Liều khử trùng bằng chiếu xạ đƣợc xác định theo tiêu chuẩn ISO-11137 (Tiêu chuẩn quốc gia TCVN7393-1:2009 (ISO 11137-1 : 2006) về Tiệt khuẩn sản phẩm chăm sóc sức khỏe - Bức xạ - Phần 1: Yêu cầu triển khai, đánh giá xác nhận và kiểm soát thƣờng quy quá trình tiệt khuẩn đối với thiết bị y tế) [92]. Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu đánh giá xác nhận và kiểm sốt thƣờng quy q trình tiệt khuẩn, u cầu cần thiết để cung cấp thiết bị y tế vô khuẩn mà những thiết bị này đã đƣợc giảm thiểu sự lây nhiễm vi sinh vật một cách ngẫu nhiên trƣớc khi tiệt khuẩn. Tính động học của sự khử hoạt tính vi sinh vật ni cấy thuần chủng bằng các tác nhân vật lý và/hoặc hóa học đƣợc sử dụng để tiệt khuẩn thiết bị y tế nói chung có thể đƣợc mơ tả bằng mối quan hệ hàm số mũ giữa số lƣợng vi sinh vật cịn sống sót với qui mơ xử lý bằng tác nhân tiệt khuẩn; điều này có nghĩa là ln có một xác suất hữu hạn mà một vi sinh vật có thể sống sót khơng phụ thuộc mức độ xử lý đƣợc áp dụng. Để xử lý, xác suất sống sót đƣợc xác định bằng số lƣợng và sức kháng của các vi sinh vật và mơi trƣờng mà trong đó vi sinh vật tồn tại trong thời gian xử lý. Điều đó dẫn đến một thiết bị y tế bất kỳ trong số thiết bị y tế đƣợc đƣa vào q trình tiệt khuẩn khơng thể đƣợc bảo đảm vô khuẩn và sự vô khuẩn của số thiết bị y tế đã đƣợc tiệt khuẩn đƣợc xác định bằng xác suất có vi sinh vật sống sót tồn tại trên thiết bị y tế. Tiêu chuẩn này mô tả các yêu cầu mà khi đáp ứng sẽ cung cấp một q trình tiệt khuẩn có hoạt tính diệt khuẩn thích hợp bằng bức xạ dùng để tiệt khuẩn các thiết bị y tế. Hơn nữa, sự phù hợp với các yêu cầu đảm bảo rằng hoạt tính này là đáng tin cậy và độ tái lập có thể đƣợc dự đốn, với sự tin cậy hợp lý, có thể có một mức xác suất thấp có vi sinh vật sống sót tồn tại trên sản phẩm sau khi tiệt khuẩn.
Liều hấp thụ (absorbed dose)
Liều (dose): Lƣợng năng lƣợng bức xạ ion hóa tác động lên một đơn vị khối lƣợng của vật liệu đã quy định.
Đơn vị của liều hấp thụ là gray (Gy), trong đó: 1 Gy tƣơng đƣơng với sự hấp thụ của 1J/kg.
Trong tiêu chuẩn này, thuật ngữ liều đƣợc dùng có nghĩa là “liều hấp thụ”.
Vi sinh vật tạp nhiễm (bioburden): Quần thể vi sinh vật sống sót trên hoặc trong sản phẩm và/hoặc hệ thống ngăn vô khuẩn.
Giá trị D10 (D10 value): Thời gian hoặc liều chiếu xạ cần thiết để đạt đƣợc sự khử hoạt tính 90 % quần thể vi sinh vật thử nghiệm trong điều kiện đã đƣợc công bố. Trong bộ tiêu chuẩn TCVN 7393 (ISO 11137), giá trị D biểu thị liều bức xạ cần thiết để đạt đƣợc sự giảm bớt 90 % quần thể vi sinh vật thử nghiệm.
Thiết lập liều tiệt khuẩn
Phải thiết lập liều tiệt khuẩn cho sản phẩm. Một trong hai phƣơng pháp tiếp cận nhƣ đƣợc mô tả trong a) và b) dƣới đây phải đƣợc sử dụng trong việc thiết lập liều tiệt khuẩn:
a) Kiến thức về số lƣợng và/hoặc sức kháng xạ của vi sinh vật tạp nhiễm đƣợc thu thập và dùng để đặt liều tiệt khuẩn;
Phƣơng pháp ấn định liều tiệt khuẩn và tình huống mà ở đó phƣơng pháp này có thể áp dụng đƣợc mơ tả chi tiết trong 6.1 của TCVN 7393-2:2009 (ISO 11137-2:2006). b) Liều tiệt khuẩn 25 kGy hoặc 15 kGy đƣợc lựa chọn và chứng minh; trên cơ sở các liều đã chọn này, các nhà sản xuất ban đầu phải có bằng chứng về liều tiệt khuẩn đã đƣợc chọn có khả năng đạt đƣợc các yêu cầu tiệt khuẩn đã quy định. Phƣơng pháp VDmax25 và VDmax15 minh chứng liều tiệt khuẩn và trạng thái mà ở đó phƣơng pháp này có thể áp dụng, đƣợc mô tả chi tiết trong 6.2 của TCVN 7393- 2:2009 (ISO 11137-2:2006). Phƣơng pháp VDmax25 và VDmax15 đƣợc kết nối với sự đạt đƣợc mức đảm bảo vô khuẩn bằng 10-6
. Liều chiếu xạ gamma đƣợc sử dụng: 25,2 KGy Thời gian chiếu xạ: 30 phút
Máy chiếu xạ đƣợc sử dụng: UELR-10-15S2
Mẫu sau khi chiếu xạ có thể đƣợc bảo quản trong 3 tháng. Cơ chế diệt khuẩn
Dƣới tác dụng tia chiếu xạ các phân tử của DNA bị oxi hóa, phá hủy cấu trúc của DNA nên tế bào khơng thể phân bào. Ngồi ra chiếu xạ ảnh hƣởng đến cấu trúc của màng sinh chất và hoạt động của enzyme trao đổi chất.
Nội dung 3: Khảo sát khống hóa và sự phân hủy của vật liệu
Khảo sát khả năng tạo khống của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Hình 3.12: Ảnh SEM và EDS của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
(77%HAp: 23% β-TCP) sau 7 ngày ngâm trong dung dịch SBF
Hình 3.13: Ảnh SEM và EDS của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Hình 3.14: Ảnh SEM và EDS của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
(21% HAp:79% β-TCP) sau 7 ngày ngâm trong dung dịch SBF
Khả năng tạo khoáng đƣợc sử dụng để dự đốn các hoạt tính sinh học của vật liệu trong nghiên cứu in vitro, in vivo chẳng hạn nhƣ khả năng tạo mầm và phát
triển tinh thể apatite carbonate trên bề mặt của vật liệu [92, 93].
Chúng tơi khảo sát sự hình thành khống apatite của hydrogel alginate oxi hóa -gelatin sau thời gian ngâm vật liệu 7 ngày trong dung dịch SBF và sau đó đƣợc đơng khơ để quan sát hình ảnh SEM và phân tích EDS. Quan sát hình ảnh SEM ta thấy trên bề mặt hydrogel xuất hiện các tinh thể. Kết quả phân tích EDS các tinh thể đó cho thấy xuất hiện các nguyên tố Na, Cl trong dung dịch SBF.
Khảo sát bằng hình ảnh SEM hydrogel composite alginate oxi hóa - gelatin/BCP với lƣợng BCP 10% và 30%, sau thời gian ngâm vật liệu 7 ngày trong dung dịch SBF và đƣợc đông khô. Kết quả cho thấy trên bề mặt hydrogel composite xuất hiện các hạt tinh thể rất nhỏ. Phân tích EDS các hạt tinh thể trên cho thấy ngoài các nguyên tố Na, Cl còn xuất hiện nguyên tố C, O, P, Ca là các nguyên tố cấu thành calcium phosphate, calcium carbonate. Các kết quả nghiên cứu của Mohamed [94], Amir [95], Gu [96] khẳng định: BCP tăng cƣờng khả năng tạo khống với vai trị nhƣ các mầm apatite carbonate, đồng thời cũng là nguồn cung cấp ion calcium và ion phosphate cho quá trình phát triển mầm tinh thể và tinh thể apatite carbonate.
Hình 3.15: Giản đồ XRD của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel
composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (66%HAp:34% β-TCP) sau khi ngâm trong dung dịch SBF 7 ngày
Phân tích cấu trúc pha của hydrogel composite trƣớc và sau khi ngâm hydrogel composite trong dung dịch SBF bằng phƣơng pháp nhiễu xạ XRD khẳng định sự hình thành khống apatit của hydrogel composite sau khi ngâm trong dung dịch SBF. Giản đồ nhiễu xạ XRD của hydrogel và hydrogel composite trƣớc khi ngâm SBF có các tín hiệu tinh thể HAp 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411) điều này khẳng định sự tạo thành của khoáng apatit của hydrogel composite sau khi ngâm trong dung dịch SBF.
Hình 3.16: Phổ FTIR của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
(66%HAp: 34% β-TCP) trƣớc và sau khi ngâm trong dung dịch SBF 7 ngày So sánh phổ FTIR của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP trƣớc và sau khi ngâm trong dung dịch SBF 7 ngày khơng xuất hiện tín hiệu mới.
Do đó trên cơ sở kết quả thực nghiệm cho thấy hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP có hiệu quả trong quá trình hình thành và phát triển của khoáng apaptite. Sự xuất hiện của nguyên tố C, O trong kết quả phân tích nguyên tố EDS là kết quả do polymer phủ lên khoáng apatite trong quá trình trình giảm cấp hydrogel composite.
Khảo sát khối lƣợng giảm cấp của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Hình 3.17: Đồ thị % khối lƣợng giảm cấp của hydrogel alginate oxi hóa-
gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP, (A): 77%HAp: 23% β- TCP), (B): 66%HAp: 34% β-TCP, (C): 21% HAp: 79% β-TCP, p<0,05
Kết quả khảo sát khối lƣợng giảm cấp của hydrogel alginate oxi hóa -gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa -gelatin/BCP cho thấy hydrogel khơng có BCP khối lƣợng giảm cấp nhanh hơn so với hydrogel composite có BCP (hình 3.17). Khảo sát khối lƣợng giảm cấp của hydrogel composite alginate oxi hóa – gelatin/BCP sau 4 tuần ( hình 3.17A), khối lƣợng mất đi của hydrogel alginate oxi hóa -gelatin là 32,6% 0,5; alginate oxi hóa –gelatin/10%BCP là 31,5% 0,6,
alginate oxi hóa –gelatin/10%BCP là 29,7% 0,4. Đối với mẫu có BCP với tỷ lệ
thành phần 66%HAp: 34% β-TCP có khối lƣợng giảm cấp lần lƣợt là 32,6 0,5
(0% BCP), 31,12 0,23 (10% BCP) và 29,17% 0,37 (30% BCP). Mẫu dùng BCP có thành phần 21% HAp: 79% β-TCP cho % khối lƣợng giảm cấp sau 4 tuần là 32,6
0,5 (0% BCP), 30,85 0,45 (10% BCP) và 28,64 0,69 (30%BCP). Khi so sánh
ở mức độ tin cậy 95%, các mẫu đều cho thấy có sự khác biệt, nhƣ vậy có thể kết luận rằng % khối lƣợng giảm cấp của vật liệu phụ thuộc vào hàm lƣợng BCP có trong mẫu hydrogel composite ( phụ lục 4, 5 và 6).
Lƣợng BCP trong hydrogel composite càng tăng thì khối lƣợng (%) giảm cấp của hydrogel composite càng nhỏ. Điều này có thể giải thích do tƣơng tác của các hạt BCP và gelatin. Nhóm chức NH2, OH, COOH của gelatin liên kết hydrogen với nhóm OH của HAp trong BCP, ngồi ra cịn có liên kết tạo phức của nhóm NH2 của gelatin và ion Ca2+ của BCP [92-94].
Ngoài ra khi hàm lƣợng β-TCP trong BCP cao, hydrogel composite sẽ giảm cấp nhanh hơn do độ tan của β-TCP cao hơn HAp [95].
Hình 3.18: Hàm lƣợng Ca trong dung dịch SBF ngâm hydrogel composite
alginate oxi hóa-gelatin/BCP, (A): 77%HAp: 23% β-TCP), (B): 66%HAp: 34% β- TCP, (C): 21% HAp:79% β-TCP, NS: non significant, p<0,05
Hình 3.19: Hàm lƣợng P trong dung dịch SBF ngâm hydrogel composite
alginate oxi hóa-gelatin/BCP, (A): 77%HAp: 23% β-TCP), (B): 66%HAp: 34% β- TCP, (C): 21% HAp:79% β-TCP, NS: non statistic, p<0,05
Khảo sát hàm lƣợng Ca, P trong dung dịch SBF sau khi ngâm hydrogel trong dung dịch SBF cho thấy hàm lƣợng Ca, P trong dung dịch SBF ngâm mẫu hydrogel không thay đổi trong thời gian 7 ngày khảo sát. Theo thống kê số liệu, hàm lƣợng
Ca (100 0,56; p>0,05), P (31,07 0,38; p>0,05) (Phụ lục 7-12) trong dung dịch
SBF ngâm hydrogel khơng có sự khác biệt giữa các thời gian khảo sát khác nhau. Do đó có thể kết luận mẫu hydrogel không ảnh hƣởng đến hàm lƣợng Ca, P khi ngâm trong dung dịch SBF.
Khảo sát hàm lƣợng Ca, P trong dung dịch SBF sau khi ngâm hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP cho thấy sau 3 ngày lƣợng ion Ca , P tăng lên, sau 7 ngày hàm lƣợng Ca, P giảm xuống. Các mẫu hydrogel composite cho kết quả thống kê có sự khác biệt giữa các thời gian khảo sát khác nhau (p<0,05), nhƣ vậy hydrogel composite có ảnh hƣởng đến hàm lƣợng Ca, P khi ngâm mẫu hydrogel composite trong dung dịch SBF.
Sự tăng lên về hàm lƣợng Ca, P sau 3 ngày ngâm mẫu trong dung dịch SBF là do q trình hịa tan của BCP giải phóng ion Ca2+ và ion phosphate. Sau 7 ngày q trình kết tủa khống apatite làm giảm lƣợng Ca, P trong dung dịch SBF.
Ngoài ra, khi hàm lƣợng β-TCP trong BCP cao thì hàm lƣợng Ca, P trong dung dịch SBF ngâm mẫu cao. Kết quả này có thể giải thích do độ tan của β-TCP cao hơn HAp.
Việc khảo sát hàm lƣợng Ca, P trong dung dịch SBF ngâm mẫu sau và EDS, XRD phân tích mẫu sau khi ngâm trong dung dịch SBF cho thấy sau 7 ngày ngâm hydrogel composite trong dung dịch SBF có sự kết tủa khoáng apatite.
Các mẫu hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP với các tỉ lệ HAp:β-TCP khảo sát đều có khả năng khống hóa.
Theo các nghiên cứu của Carlos A. Garrido và cộng sự [96] sản phẩm BCP với tỉ lệ % khối lƣợng -TCP:HAp là 35: 65 phù hợp với ứng dụng cho xƣơng. Cho nên chúng tơi sử dụng sản phẩm BCP có % khối lƣợng -TCP:HAp là 34:66 dùng tạo hydrogel composite nhằm giúp xƣơng phát triển (BCP đƣợc tổng hợp với tỉ lệ mol Ca/P là 1,53; pH môi trƣờng phản ứng là 9).
Hình 3.20: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và
hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (p<0.05)
Tính tƣơng hợp sinh học của hydrogel composite alginate oxi hóa- gelatin/BCP đƣợc khảo sát trên cơ sở độc tính tế bào của vật liệu và trên cơ sở sự bám dính và phát triển của tế bào trên vật liệu.
Độc tính tế bào của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa -gelatin/BCP đƣợc khảo sát bằng phƣơng pháp MTT trên tế bào xƣơng MG-63.
Kết quả khảo sát tính tƣơng hợp sinh học trên cơ sở độc tính tế bào của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa- gelatin/BCP cho thấy: với các nồng độ pha loãng dung dịch chiết mẫu khác nhau (0, 25, 50, 75, 100%) cả hydrogel alginate oxi hóa -gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa -gelatin/BCP đều có tỉ lệ sống của tế bào trên 90%.
Dựa trên tiêu chuẩn ISO 10993-5, 1999 (vật liệu không độc đối với tế bào khi tại các nồng độ pha loãng dung dịch chiết mẫu tỉ lệ tế bào sống đều cao hơn