Năm 2012 Kim và cộng sự [51] nghiên cứu composite trên cơ sở BCP- collagen mang nhân tố phát triển rhBMP -2 ảnh hƣởng đến sự tái tạo xƣơng. Đánh giá lành thƣơng sau phẫu thuật cho thấy khơng có sự nhiễm trùng tại vùng phẫu thuật. Sau 8 tuần, kết quả phân tích micro-CT và nhuộm mô xƣơng cho thấy mơ xƣơng mới hình thành.
Năm 2012 Barbani và cộng sự [52] nghiên cứu vật liệu composite trên cơ sở Hydroxyapatite/gelatin/gellan dùng trong lĩnh vực tái tạo xƣơng. Tác giả nghiên cứu đặc điểm hình thái học, tính chất hóa lý, tính chất cơ học và sinh học của composite dựa trên gelatin, gellan và hydroxyapatite, mô phỏng các thành phần của xƣơng. Kỹ thuật đông khô đƣợc sử dụng để tạo thành phần, cấu trúc xốp của vật liệu. Phân tích hình thái học cho thấy độ xốp đồng nhất, với lỗ xốp kết nối với nhau. Sự tƣơng tác giữa các thành phần đã đƣợc chứng minh thông qua các phƣơng pháp phân tích hóa lý. Ngồi ra, phân tích phổ hồng ngoại chỉ ra sự giống nhau giữa composite và các xƣơng tự nhiên, về thành phần hóa học, tính đồng nhất, tƣơng tác phân tử. Đặc tính sinh học ban đầu cho thấy độ bám dính và phát triển của các tế bào gốc xƣơng ngƣời lên vật liệu tốt. Sự hình thành liên kết ion giữa ion Ca2+ trong mạng tinh thể HAp và các nhóm carboxyl trong các đơn vị acid glucuronic của chuỗi gellan (GE) giải thích việc bổ sung GE gel có thể cải thiện các tính chất cơ học của vật liệu, thực tế này là do sự tƣơng tác giữa các nhóm carboxylate của GE và amide nhóm (gelatin) gel. Ngồi ra tƣơng tác rất mạnh mẽ giữa hai phân tử có thể là liên kết ion giữa nhóm carboxyl gel và các nhóm aminee mặt của một acid amine cơ bản của chuỗi peptide gel, nhƣ lysine. Chuỗi gel đã đƣợc liên kết ngang, ngƣng tụ dƣ lƣợng glutamine với các đơn vị polypeptide của các acid amine có chứa nhóm amine, do tác động của các chất xúc tác enzyme transglutaminase (TGase). Kỹ thuật này sử dụng các phản ứng liên kết ngang enzyme trung gian TGase xảy ra tự nhiên trong cơ thể. Kết quả cho thấy có sự tƣơng tác giữa các thành phần hữu cơ và vô cơ trong composite, vật liệu tƣơng hợp sinh học. Tuy nhiên sự tạo khoáng và thời gian giảm cấp của vật liệu chƣa đƣợc tác giả đề cập.
Năm 2012 Isikli và cộng sự [53] nghiên cứu vật liệu composite xốp trên cơ sở chitosan, gelatin và hydroxyapatite ứng dụng làm vật liệu cho xƣơng. Tác giả sử
dụng chất 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) là chất tạo liên kết ngang. Phƣơng pháp đông khô đƣợc sử dụng để tạo thành phần, cấu trúc xốp. Nghiên cứu so sánh ảnh hƣởng của hydroxyapatite không thiêu kết (NSHA) hoặc thiêu kết hydroxyapatite (SHA) đến tính chất vật lý, hóa học và sinh học của vật liệu composite. Các phƣơng pháp phân tích nhiễu xạ tia X (XRD), phổ hồng ngoại (FTIR), kính hiển vi quét điện tử (SEM) đƣợc sử dụng phân tích thành phần, cấu trúc và hình thái của NSHA và SHA. Tính chất cơ lý của composite tăng khi có NSHA, SHA, mơ đun Young và cƣờng độ nén của composite có giá trị tƣơng tự nhƣ xƣơng xốp của con ngƣời. Khảo sát sự phát triển của tế bào Saos-2 trong điều kiện nuôi cấy (in vitro) cho thấy sự phát triển của tế bào trên vật liệu C-G/SHA cao hơn trên vật liệu C-G/NSHA. Sự tạo khoáng và thời gian giảm cấp của vật liệu chƣa đƣợc tác giả đề cập.
Năm 2013 Hunter và cộng sự [54] đánh giá sự phát triển và biệt hóa tế bào gốc xƣơng ngƣời trong điều kiện nuôi cấy (in vitro) của hydroxyapatite, chitosan, gelatin trong tái tạo xƣơng. Vật liệu sinh học dựa trên cơ sở chitosan và HAp, gelatin có thành phần thành phần, cấu trúc tƣơng tự xƣơng đƣợc nghiên cứu cho lĩnh vực tái tạo xƣơng. Trong nghiên cứu này, sự tƣơng tác của tế bào gốc xƣơng ngƣời (hMSC) với màng composite trên trên cơ sở chitosan, gelatin và HAp (HCG) đã đƣợc nghiên cứu. Sự kết hợp của HCG hình thành một màng giảm cấp sinh học với 60% khối lƣợng nƣớc và độ cứng ban đầu là 20 kPa. Các biểu hiện của các protein xƣơng và các gen cho thấy màng HCG thúc đẩy sự phát triển của hMSC, và sự biệt hóa tạo xƣơng. Màng HCG tƣơng tác với protein huyết thanh và tế bào gốc xƣơng ngƣời đặc trƣng. Kết quả của nghiên cứu này chứng minh rằng màng HCG có thể tạo thành một môi trƣờng thúc đẩy hMSC phát triển, giúp tăng cƣờng sự biệt hóa tế bào xƣơng. Màng composite có thành phần, cấu trúc và đặc tính mong muốn cần thiết cho các ứng dụng nhƣ màng trong tái tạo mô xƣơng. Tuy nhiên tác giả chƣa khảo sát khả năng tạo khoáng của vật liệu cũng nhƣ thời gian giảm cấp của vật liệu.
Năm 2013, Pasqui và cộng sự [55] nghiên cứu carboxylmethyl cellulose/HAp composite ứng dụng làm vật liệu cho xƣơng. Tế bào xƣơng MG63 phát triển tốt trên carboxylmethyl cellulose/HAp composite, thành phần, cấu trúc
xốp của vật liệu giúp tế bào xâm nhập và phát triển bên trong vật liệu. Tuy nhiên sự giảm cấp của vật liệu chƣa đƣợc đề cập.
Năm 2013, Khaled và cộng sự [56] nghiên cứu in vitro của composite nano- hydroxyapatite/chitosan–gelatin về sự tạo khoáng của composite, bằng các phƣơng pháp Uv-Vis khảo sát nồng độ ion calcium, phosphate trong dung dịch SBF (simulated body fluid) sau khi ngâm composite, SEM, FTIR chứng minh sự tạo thành của khoáng apatite sau 7 ngày ngâm composite trong dung dịch SBF. Trong nghiên cứu tác giả tổng hợp hydroxyapatite bằng phƣơng pháp kết tủa H3PO4 (hòa tan chitosan, gelatin) và Ca(OH)2 (trong mội trƣờng ethanol). Gelatin trong composite khơng tạo liên kết hóa học với chitosan nên gelatin dễ tan vào dung dịch dẫn đến sự giảm cấp của composite tăng khi tăng lƣợng polymer. Composite khơng có cấu trúc xốp nên tế bào chỉ có thể phát triển trên bề mặt vật liệu.
Năm 2013, Chen và cộng sự [57] nghiên cứu composite trên cơ sở hyaluronic acid-chitosan-poly(N-isopropyacrylamide) và biphasic calcium phosphate (HA-CPN/BCP). Hydrogel composite HA-CPN/BCP, gel nhạy nhiệt tạo gel ở nhiệt độ cơ thể ngƣời, có thể tiêm vào vùng khiếm khuyết xƣơng giảm thiểu phẫu thuật, tế bào xƣơng hFOB phát triển tốt trên vật liệu. Vật liệu composite mang tế bào xƣơng hFOB đƣợc cấy dƣới da chuột để khảo sát sự phát triển của tế bào, kết quả tạo thành mơ xƣơng mới tại vị trí cấy ghép. Vật liệu composite có thành phần, cấu trúc xốp, tƣơng hợp sinh học, tế bào xƣơng phát triển tốt trên vật liệu tuy nhiên tính chất cơ lý của vật liệu thấp (E<0.7 MPa) và sự giảm cấp của vật liệu chƣa đƣợc đề cập.
Năm 2013 Seris và cộng sự [58] nghiên cứu lâm sàng cấy ghép vật liệu composite trên cơ sở BCP và hydroxy propyl methyl cellulose. Khôi phục lại thành phần, cấu trúc xƣơng sau khi mất xƣơng là nhu cầu cấp bách, sử dụng các sản phẩm thay thế xƣơng làm bằng calcium phosphate đã trở nên phổ biến. Sự kết hợp của CaP và hydroxy propyl methyl cellulose tạo vật liệu composite In'OssTM. Mục đích của nghiên cứu lâm sàng để chứng minh tính an tồn và hiệu quả của các sản phẩm thay thế xƣơng bioceramic/hydrogel trong việc tái tạo xƣơng sau phẫu thuật hàm mặt. In'OssTM vật liệu sinh học đã đƣợc tiêm vào các khuyết tật xƣơng đƣợc tạo ra khi loại bỏ răng của 78 bệnh nhân. Điểm đáng chú ý, khơng có phản ứng cơ thể
nhiễm trùng xảy ra trong thời gian ít nhất là 17 tháng. Vật liệu sinh học đã đƣợc sử dụng để bảo quản ổ răng sau khi nhổ răng, xƣơng đã dần dần thay thế các vật liệu sinh học. Trong quá trình khoan cho cấy ghép nha khoa, mật độ tƣơng tự nhƣ xƣơng tự nhiên, và sự ổn định cấy ghép hoàn hảo trong hơn 90% các trƣờng hợp. Trong thực tế, 6 tháng, 95% vật liệu đƣợc thay thế bằng xƣơng sinh lý. Hơn nữa, xƣơng mới đƣợc hình thành có thành phần, cấu trúc xƣơng xốp nối liền với nhau. BCP hạt đã đƣợc sử dụng trong sự phát triển của hệ thống In'OssTM, đại diện cho một thế hệ mới của thay thế xƣơng. BCP hạt đã đƣợc kết hợp với các polymer để phát triển các sản phẩm thay thế xƣơng tiêm (IBS). Các dữ liệu lâm sàng, X quang và mô học từ nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh tính an tồn và hiệu quả của các In'Oss thay thế xƣơng trong tái tạo xƣơng trong phẫu thuật.
Năm 2014 Nguyen và các cộng sự [59] đã tổng hợp hydrogel composite Hyaluronic acid (HyA)-Gelatin (Gel)/biphasic calcium phosphate (BCP) ứng dụng trong tái tạo xƣơng. Các lỗ xốp của vật liệu liên thơng với nhau và có tính cơ học tốt (lực nén 2,8±0,15 MPa) nên có thể ứng dụng thay thế cho xƣơng. Vật liệu HyA- Gel/BCP có tính tƣơng hợp sinh học tốt. Ngồi ra, in vivo cho thấy HyA-Gel/BCP sau khi cấy ghép 3 tháng xƣơng mới đƣợc hình thành và tạo khoáng với tốc độ nhanh.
Các cơng trình nghiên cứu vật liệu hydrogel composite có khả năng tái tạo xƣơng trên cơ sở calcium phosphate và polymer tự nhiên nhƣ gelatin, chitosan, hyaluronic acid, collagen tuy nhiên thời gian phân hủy của các vật liệu này ngắn, chƣa phù hợp với thời gian phát triển của xƣơng. Trên cơ sở kết quả kinh nghiệm chúng tôi đã làm tại bệnh viện đại học Soonchunhyang-Hàn quốc, vật liệu hydrogel composite sinh học trên cơ sở calcium phosphate, alginate và gelatin có khả năng kích thích phát triển tế bào xƣơng rất tốt đồng thời thời gian phân hủy của vật liệu phù hợp với thời gian xƣơng phát triển [16]. Vật liệu hydrogel composite sinh học trên cơ sở BCP và oxidized alginate, gelatin, vật liệu tiềm năng đầy hứa hẹn trong lĩnh vực tái tạo xƣơng. Cấu trúc xốp 3D của hydrogel tạo điều kiện cho tế bào phát triển bên trong vật liệu giúp xƣơng phát triển bên trong vật liệu. Chúng tôi chọn vật liệu trên vì chúng tƣơng tự các thành phần của xƣơng. Gelatin có nguồn gốc từ collagen, gelatin rất tƣơng hợp sinh học nên ứng dụng nhiều trong y học. Alginate
là một polysaccharide phân hủy sinh học, tƣơng thích với extracellular matrix của tế bào. BCP tƣơng hợp sinh học, BCP dần dần hòa tan và giải phóng các ion canxi và phosphate, có lợi để hình thành xƣơng. Hydrogel composite này tạo thành một môi trƣờng phỏng theo môi trƣờng sinh học của xƣơng với sự tƣơng hợp sinh học cao, khi hydrogel composite phân hủy sinh học sẽ thúc đẩy q trình tái tạo mơ xƣơng, xƣơng mới hình thành thay thế dần hydrogel composite đƣợc cấy ghép.
Quá trình tạo mẫu gồm 2 giai đoạn: giai đoạn oxi hóa sodium alginate, và giai đoạn tạo gel oxidized alginate-gelatin-BCP. Phản oxi hóa sodium alginate là phản ứng đặc biệt để biến đổi polysaccharide, trong phản ứng này hai nhóm OH trên cacbon 2 và 3 của đơn vị acid uronic bị oxi hóa bởi sodium periodate dẫn đến cắt vòng cacbon và tạo thành 2 nhóm CHO. Phản ứng tạo gel là phản ứng Schiff base giữa nhóm aldehyde của oxidized alginate và nhóm amin của gelatin, chúng tôi đã không đƣa thêm chất tạo liên kết ngang, vật liệu ban đầu đã phản ứng với nhau để tạo liên kết ngang, điều kiện phản ứng tạo gel êm dịu không cần nhiệt độ cao, mơi trƣờng trung tính. Lƣợng nƣớc hấp thụ, thời gian phân hủy, tính chất cơ lý của hydrogel composite phụ thuộc độ oxi hóa của oxidized alginate.
Độ oxi hóa của oxidized alginate cao dẫn đến mật độ tạo liên kết ngang tăng nên lƣợng nƣớc hấp thụ, thời gian phân hủy, tính chất cơ lý của hydrogel composite tăng. Vật liệu hydrogel composite trên cơ sở oxidized alginate, gelatin, BCP có lƣợng nƣớc hấp thụ lớn, chịu lực nén cao và thời gian phân hủy phù hợp với thời gian xƣơng phát triển. Khảo sát độc tính của vật liệu đối với tế bào xƣơng MG-63 cho thấy vật liệu khơng có độc tính. Những kết quả trên cho thấy vật liệu composite oxidized alginate/gelatin/BCP có thể sử dụng trong việc tái tạo xƣơng. Ƣu điểm của vật liệu hydrogel composite trên cơ sở oxidized alginate-gelatin-BCP:
Cấu trúc và thành phần thích hợp cho sự phát triển xƣơng Tƣơng hợp sinh học: 75%<cell viability<85%
Thời gian phân hủy sinh học phù hợp thời gian tái tạo xƣơng
Những điểm cần hồn thiện của quy trình tổng hợp hydrogel composite sinh học biphase calcium phosphate-oxidized alginate, gelatin trong đề tài đã thực hiện:
Thay đổi thành phần BCP (HAp:TCP) và tỉ lệ khối lƣợng polyme/BCP: Đánh giá khả năng khống hóa của vật liệu, tối ƣu hóa thành phần nhằm tìm vật liệu có độ khống hóa cao.
Ngồi ra chúng tơi cần khảo sát khả năng phát triển tế bào gốc của thỏ trên vật liệu và cấy ghép vật liệu trên xƣơng thỏ. Đánh giá sự phát triển của xƣơng sau khi cấy ghép vật liệu composite vào xƣơng đùi thỏ dựa trên kết quả phân tích micro-CT về mật độ xƣơng và kết quả phân tích mơ học.
Trong bƣớc 2 chúng tôi cần thay đổi tỉ lệ HAp: TCP trong BCP và thay đổi tỉ lệ BCP:polymer.
Thay đổi thành phần BCP
Thay đổi tỉ lệ khối lƣợng BCP: polyme Nội dung nghiên cứu:
1. Hoàn thiện vật liệu:
Giảm độ oxi hóa của oxidized alginate: 35% < độ oxi hóa< 40%. Thay đổi thành phần BCP.
Thay đổi tỉ lệ khối lƣợng BCP: polyme Khảo sát khả năng khống hóa của vật liệu.
2. Khảo sát khả năng phát triển tế bào gốc của thỏ trên vật liệu. 3. Cấy ghép vật liệu trên xƣơng thỏ.
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1. Hóa chất, nguyên vật liệu
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất
Hóa chất Nguồn gốc
Gelatin (Type A, MW 100,000) Sigma–Aldrich, USA
Sodium periodate Merck, Germany
Sodium chloride (NaCl) Scharlau, España Calcium chloride (CaCl2.2H2O) Merck, Germany Tri-sodium phosphate (Na3PO4.12H2O) Merck, Germany
Sodium hydroxyte NaOH Merck, Germany
Sodium bicarbonate NaHCO3 Merck, Germany Di-sodium hydro phosphate Na2HPO4.2H2O Merck, Germany
Potassium chloride KCl Merck, Germany
Magiesium chloride MgCl2.6H2O Merck, Germany
HCl Merck, Germany
Sodium sulphate Na2SO4 Merck, Germany
Tris (CH2OH)3CNH2 Sigma–Aldrich, USA
Phosphate buffered salinetablets (PBS) Amresco, South Korea 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5
Diphenyltetrazolium bromide (MTT) Gibco Carlsbad, CA Dimethylsulfoxid 99.0%(DMSO) Gibco Carlsbad, CA Fetal bovine serum (FBS) Gibco Carlsbad, CA Dulbecco’s Modification of Eagle’s (DMEM) HyClone, Logan, UT Penicillin streptomycin antibiotic (PS), Gibco Carlsbad, CA
Trypsin-EDTA Gibco Carlsbad, CA
Hydroxyapatite Taihei, Osaka, Japan
β-TCP Taihei, Osaka, Japan
MG-63 tế bào xƣơng (nguồn gốc từ human osteosarcomas): Ngân hàng tế bào Hàn Quốc.
Thỏ đực NewZealand, 4 đến 6 tháng tuổi, cân nặng 2,5 đến 3,0 kg đƣợc cung cấp bởi Viện Pasteur Nha Trang.