Sau khi vô trùng mẫu hydrogel composite, mẫu đƣợc đặt trong đĩa cấy 24 giếng, tế bào gốc từ tủy xƣơng thỏ đƣợc cấy lên vật liệu với mật độ 5104 tế bào/giếng. Sau thời gian nuôi cấy nhân tế bào đƣợc nhuộm với DAPI (20mg/mL) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, mẫu đƣợc rửa 3 lần bằng dung dịch PBS. Tế bào đã đƣợc nhuộm màu trên hydrogel composite đƣợc quan sát qua kính hiển vi huỳnh quang [63].
NỘI DUNG 6 : Thử nghiệm cấy ghép vật liệu hydrogel composite sinh học trên cơ
sở biphase calcium phosphate (BCP)-oxidized alginate, gelatin trên thỏ.
Phẫu thuật
Chích thuốc mê
Cố định thỏ, chọn vùng phẫu thuật, cạo lông vùng phẫu thuật Cô lập vùng phẫu thuật, sát trùng vùng phẫu thuật
Rạch da, lật vạt Khoan lỗ 5/5 mm
Bơm rửa nƣớc muối sinh lý, kiểm sốt chảy máu.
Vị trí ghép: Lấp đầy vật liệu ghép vào lỗ khoan, nhồi nén cho đầy đến miệng lỗ khoan. Đặt màng- khâu kín.
Vị trí đối chứng: Bơm rửa sạch bằng nƣớc muối sinh lý, kiểm soát chảy máu. Đặt màng- khâu kín.
Đánh dấu vị trí phẫu thuật bằng 2 vít kim loại cắm vào vùng xƣơng lành 2 bên miệng lỗ khoan, cách thành lỗ khoan 1mm. Sau khi lành vết thƣơng, bộc lộ vị trí nghiên cứu dựa vào dấu sẹo lƣu trên da, sẽ nối 2 điểm này lại để xác định tâm lỗ khoan, làm cơ sở cho việc lấy mẫu mơ đúng vị trí nghiên cứu.
Sau phẫu thuật thỏ đƣợc theo dõi vết thƣơng nhƣ các dấu hiệu nhiễm trùng (vết thƣơng sƣng, mép vạt vết thƣơng chảy dịch có mùi hơi) và chích kháng sinh trong 14 ngày.
NỘI DUNG 7 : Chăm sóc, theo d i lành thƣơng trong 4, 6 tháng NỘI DUNG 8 : Đánh giá sự phát triển của xƣơng và tế bào
Phân tích xƣơng hình thành bằng phƣơng pháp Micro computed tomography (micro-CT)
Mẫu đƣợc quét bằng cách sử dụng hệ thống μCT (Skyscan 1072, SKYSCAN, Kontich, Bỉ. Sau khi quét, các dữ liệu hình ảnh 2D đƣợc xây dựng lại 3D. Từ những hình ảnh lát sử dụng phần mềm (TomoNT, SKYSCAN, Kontich, Bỉ) tính tốn các thông số cấu trúc: thể tích xƣơng/thể tích mơ, diện tích xƣơng/thể tích xƣơng.
Chuẩn bị tiêu bản Cố định mẫu
Mẫu xƣơng thỏ đƣợc ngâm trong dung dịch 4% formalin (48 giờ ở nhiệt độ phịng), sau đó ngâm mẫu xƣơng trong dung dịch ethanol 70%.
Khử khoáng xƣơng
Ngâm mẫu trong 11% formic acid qua đêm Rửa mẫu dƣới nƣớc trong 30- 60
Cố định mẫu trong parafin
70% ethanol trong 1 giờ
95% ethanol (95% ethanol/5% methanol) trong 1 giờ Ngâm mẫu trong ethanol trong 1 giờ
Ngâm mẫu trong ethanol trong 1,5 giờ (2lần) Ngâm mẫu trong ethanol trong 2 giờ
Ngâm mẫu trong xylene trong 1 giờ (2 lần) Ngâm mẫu trong nến ở 58°C trong 1 giờ (2 lần)
Kỹ thuật nhuộm thƣờng quy H&E Mục đích:
Nhuộm HE: Khảo sát cấu trúc mơ xƣơng, hình thái, các thành phần khác trong mơ xƣơng. Hematoxylin có màu xanh-tím, Eosin có màu hồng.
Rửa tiêu bản với:
100% xylene 3 phút (3 lần) 50:50 xylene/100% ethanol 3 phút 100% ethanol 3 phút (2 lần) 95% ethanol 3 phút (2 lần) Rửa nƣớc cất Hematoxylin (Gill’s 1X) 5 phút
Rửa tiêu bản dƣới nƣớc máy trong 5 phút
Ngâm tiêu bản 2-3 phút trong dung dịch (1%HCl trong 70% ethanol) Rửa tiêu bản dƣới nƣớc máy trong 3-5 phút
Ngâm tiêu bản 2-3 phút trong dung dịch (1mL NH4OH trong 1L H2O) Rửa tiêu bản dƣới nƣớc máy trong 3-5 phút
Ngâm tiêu bản 1 phút trong dung dịch Eosin Y Rửa tiêu bản dƣới nƣớc máy trong 3-5 phút 95% ethanol 2 phút (3 lần)
50:50 xylene/100% Ethanol 2 phút 100% xylene 2 phút (3 lần).
2.4. Xử lý thống kê số liệu thí nghiệm
Phân tích thống kê đƣợc thực hiện bằng phần mềm thống kê SPSS ver 22 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) và excel. Phân tích phƣơng sai 2 yêu tố (ANOVA) dùng để so sánh hàm lƣợng Ca, P sản sinh trong q trình khống hóa trong dung dịch SBF và đánh giá xƣơng mới đƣợc hình thành ở mỗi nhóm trong phân tích kết quả Micro-CT. Mức ý nghĩa thống kê đƣợc sử dụng là 5%. Số lần lập cho mỗi thí nghiệm là 3.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nội dung 1: Nghiên cứu tổng hợp hydrogel composite sinh học trên cơ sở biphase calcium phosphate-oxidized alginate, gelatin
Nội dung 1.1 Tổng hợp oxidized-alginate từ sodium alginate
Alginate là polymer tự nhiên chiết xuất từ tảo nâu, bao gồm acid (1-4)-BD- mannuronic (M) và acid (1-4)-Al-guluronic (G) các đơn vị dƣới hình thức homopolymeric (MM hoặc GG-khối) và trình tự heteropolymeric (MG-hoặc GM- khối). Alginate có tính tƣơng hợp sinh học nên alginate và các dẫn xuất của chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm và dƣợc phẩm, vật liệu y sinh. Nhƣợc điểm của alginate là tính bám dính tế bào thấp và không hỗ trợ quá trình phát triển của tế bào. Để khắc phục nhƣợc điểm trên, biến tính alginate, sau dó dùng dẫn xuất alginate kết hợp với gelatin để tăng tính bám dính tế bào của vật liệu. Oxi hóa alginate đƣợc dùng để biến tính alginate, sau đó dùng alginate đã biến tính tạo liên kết với gelatin. Phản ứng oxi hóa sodium alginate là phản ứng đặc biệt để biến
đổi polysaccharide, trong phản ứng này hai nhóm OH trên cacbon 2 và 3 của đơn vị acid uronic bị oxi hóa bởi sodium periodate dẫn đến cắt vòng cacbon và tạo thành 2 nhóm CHO.
Độ oxi hóa càng cao có nghĩa là nhóm CHO tạo ra càng nhiều, nhóm CHO khơng những đóng vai trị tạo liên kết ngang trong mạng lƣới hydrogel mà cịn tăng khả năng bám dính mơ nên vật liệu dựa trên phản ứng Schiff-base giữa các nhóm aldehyde của oxidized alginate và nhóm amine của collagen có trong mơ xƣơng. Tuy nhiên độ oxi hóa cao, trên chuỗi alginate xuất hiện nhiều nhóm aldehyde có thể gây độc cho tế bào.
Bảng 3.1: Thơng số thí nghiệm khảo sát phản ứng oxi hóa sodium alginate
Tỉ lệ n alginate/n NaIO4 1.34 1
Thời gian phản ứng (h) 12 24 12 24
Độ oxi hóa (%) 19 25 36 43
Phổ H1NMR của các mẫu oxidized alginate xuất hiện các mũi 5,15 and 5,4 ppm, tƣơng ứng với hemiacetalic proton khẳng định sodium alginate đã biến tính, hai nhóm OH trên cacbon 2 và 3 của đơn vị acid uronic bị oxi hóa bởi sodium periodate dẫn đến cắt vòng cacbon và tạo thành 2 nhóm CHO [78].
Để đạt đƣợc độ oxi hóa của oxidized alginate: 35% < độ oxi hóa< 40% cần thực hiện phản ứng với các thông số sau:
- Tỉ lệ n alginate/n NaIO4: 1 - Thời gian phản ứng: 12h - Độ oxi hóa : 36%
Nội dung 1.2 Tổng hợp hạt nano biphase calcium phosphate (BCP) Kết quả phân tích XRD của BCP
Hình 3.4: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53
Hình 3.5: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,67
Giản đồ nhiễu xạ tia X của các mẫu nghiên cứu đƣợc tổng hợp với tỉ lệ mol Ca/P = 1,48 (hình 3.3), tại pH=7 và pH=9 có các tín hiệu đặc trƣng của β-TCP: 25,80 (10 10); 27,77 (214); 31,03 (0210); 34,37 (220); 52,94 (20 20) [37, 64, 65] và
các tín hiệu đặc trƣng của HAp: 25,90 (002); 29,14 (210); 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411) [66-68]. Điều này khẳng định các mẫu đƣợc tổng hợp với tỉ lệ mol Ca/P = 1,48, tại pH=7 và pH=9 là BCP (hỗn hợp β-TCP và HAp).
Giản đồ nhiễu xạ tia X với tỉ lệ mol Ca/P = 1,48 (hình 3.3) tại pH=11 chỉ tồn tại các tín hiệu đặc trƣng của HAp: 25,90 (002); 29,14 (210); 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411) [66-68]. Điều này khẳng định các mẫu đó là HAp tại pH=11.
Trong khi đó, giản đồ nhiễu xạ tia X với tỉ lệ mol Ca/P=1,53 [hình 3.4] cũng cho kết quả giống nhƣ với tỉ lệ mol Ca/P=1,48, sản phẩm tại pH=7 và pH=9 có hai pha tinh thể β-TCP và HAp và tại pH=11 chỉ tồn tại pha HAp.
Tuy nhiên, giản đồ nhiễu xạ tia X với tỉ lệ mol Ca/P=1,67 [hình 3.4] tại pH=7 sản phẩm có hai pha tinh thể β-TCP và HAp, còn tại pH=9 và pH=11 sản phẩm chỉ có 1 pha HAp.
Các cơng trình nghiên cứu trƣớc [37] cho thấy với tỉ lệ mol Ca/P=1,50 thì tổng hợp đƣợc β-TCP, cịn với tỉ lệ mol Ca/P=1,67 [40, 41] thì sẽ tổng hợp đƣợc HAp, nên khi tỉ lệ mol Ca/P càng gần 1,67 thì xu thế tạo thành sản phẩm HAp càng nhiều. Tuy nhiên, khi mơi trƣờng phản ứng càng base thì phản ứng càng có xu thế tạo thành sản phẩm HAp. Do đó với tỉ lệ mol Ca/P=1,48 và 1,53 tại pH=7 và pH=9 phản ứng vẫn có xu hƣớng tạo thành β-TCP, nên sản phẩm có hai pha tinh thể β- TCP và HAp. Cịn tỉ lệ mol Ca/P=1,48 và 1,53 tại pH=11 sản phẩm tạo thành chỉ có HAp.
Với tỉ lệ mol Ca/P=1,67 tại pH=7 phản ứng vẫn có xu hƣớng tạo thành β- TCP, nên sản phẩm có hai pha tinh thể β-TCP và HAp. Còn tỉ lệ mol Ca/P=1,67 tại pH=9 và pH=11 sản phẩm tạo thành chỉ có HAp.
Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu đã đƣợc công bố của Bahman Mirhadi (2011) [37], Byong- Taek Lee [38].
Thành phần HAp hoặc β-TCP, theo Sylvie Raynaud [60] đƣợc tính tốn dựa trên các tín hiệu nhiễu xạ là mặt phẳng (2 1 0) tại 2θ = 29,14° hoặc mặt phẳng (2 1 1) 2θ = 31,86° đối với HAp và mặt phẳng (0 2 10) tại 2θ= 31,08° đối với β-TCP (các tín hiệu này đƣợc đánh dấu bằng mũi tên trên hình 3.3). Tỷ lệ cƣờng độ đƣợc
sử dụng để phân tích định lƣợng calcium phosphate hai pha chứa HAp và β-TCP đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn của R1 theo lƣợng (%) HAp [Phụ lục 1] hoặc đƣờng chuẩn của R2 theo lƣợng (%) β-TCP [Phụ lục 2]. Phần trăm khối lƣợng của β-TCP và HAp của các mẫu nghiên cứu đƣợc tổng hợp đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tổng hợp các thông số và phần trăm khối lƣợng của β-TCP và HAp
theo tỉ lệ mol Ca/P. Tỉ lệ mol pH R1 R2 %mβ-TCP %m HAp 1,48 7 0,29 78,4 21,6 9 0,7 51 49 11 100 1,53 7 2,8 35,8 64,2 9 2,7 33,8 66,2 11 0 0 100 1,67 7 2,0 23,2 76,8 9 100 11 100
Theo các nghiên cứu của Carlos A. Garrido và cộng sự [52] sản phẩm BCP với tỉ lệ % khối lƣợng -TCP:HAp là 35: 65 phù hợp với ứng dụng cho xƣơng. Sản phẩm BCP có % khối lƣợng -TCP:HAp là 33,8: 66,2 dùng tạo hydrogel composite nhằm giúp xƣơng phát triển (BCP đƣợc tổng hợp với tỉ lệ mol Ca/P là 1,53; pH môi trƣờng phản ứng là 9).
Kết quả phân tích IR của BCP
Hình 3.6: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53: (a) pH=7, (b)
pH=9 và (c) pH=11
Phổ đồ FTIR cho thấy tín hiệu 3573 cm1 tƣơng ứng với các dao động của nhóm OH trong HAp và tín hiệu 635 cm-1 là dao động giãn của nhóm OH trong HAp. Các dải rất mạnh tại 1032 cm-1 và 1092 cm-1 tƣơng ứng với các nhóm PO4-3. Tín hiệu 962 cm-1 tƣơng ứng với dao động bất đối xứng của liên kết P-O trong nhóm PO43-, và các tín hiệu 603 cm-1 và 570 cm-1 tƣơng ứng với dao động uốn của PO4 trong HAp [37, 64, 65, 69-74].
Kết qủa phân tích này khẳng định mẫu nghiên cứu có chứa HAp.
Do đó kết hợp kết quả phân tích FTIR với kết quả phân tích XRD có thể khẳng định tùy theo điều kiện phản ứng sẽ thu đƣợc sản phẩm là BCP (hỗn hợp β- TCP và HAp) hoặc HAp.
Kết quả khảo sát hình thái của BCP bằng hình ảnh SEM
Hình thái học của sản phẩm BCP và HAp đƣợc quan sát bằng hình ảnh SEM. Kết qủa hình SEM cho thấy: phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm (hình 3.8) cho sản phẩm kích thƣớc nano. Trong khi đó phƣơng pháp kết tủa không sử
dụng sóng siêu âm [73] cho sản phẩm có kích thƣớc micro và đa phân tán (hình 3.7).
Điều này có thể đƣợc giải thích bởi sóng siêu âm làm tăng hiệu ứng hóa học và hiệu ứng vật lý, quá trình tạo-vỡ bọt xảy ra gần bề mặt phân pha lỏng-rắn làm giảm sự tích tụ của các hạt. Ngồi ra sóng siêu âm tăng tốc độ tạo mầm tinh thể dẫn đến sản phẩm tạo thành có kích thƣớc nhỏ hơn khi khơng sử dụng sóng siêu âm [75- 77]. Vì vậy, trong nghiên cứu chúng tơi sử dụng phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm để tổng hợp BCP.
Hình 3.7: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp theo phƣơng pháp kết tủa khơng sử
dụng sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P= 1,67; tại pH=8 (h-1) và pH=9 (i-1) [73]
Hình 3.8: Hình ảnh SEM, TEM của HAp và β-TCP tổng hợp theo phƣơng
pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P =1,53 tại các pH khác nhau (7; 9; 11)
Phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm cho sản phẩm từ các phản ứng với tỉ lệ mol Ca/P =1,53 tại các pH khác nhau (7; 9; 11) đều có kích thƣớc nano. Sử dụng phần mềm xử lý hình ảnh imagej 150 cho thấy sản phẩm kết tủa kết hợp sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P =1,53 tại pH 7, 9 và 11 lần lƣợt nhƣ sau: 83,86 ± 28,96; 92,94 ± 28,96 và 68,31 ± 15,03.
Nội dung 1.3: Tổng hợp vật liệu hydrogel composite sinh học trên cơ sở biphase calcium phosphate (BCP)-oxidized- alginate, gelatin
Hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Khảo sát hình thái của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Hình 3.9: Ảnh SEM của hydrogel composite alginate oxi hóa -gelatin/BCP
với các lƣợng BCP khác nhau
Ảnh SEM đƣợc sử dụng để khảo sát hình thái học của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP với các lƣợng BCP khác nhau. Kết quả cho thấy hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP có cấu trúc khơng gian ba chiều xốp. Trong khi vật liệu đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp đúc khơng có cấu trúc xốp nhƣ hydrogel [79-82].
Cấu trúc không gian 3 chiều, xốp của hydrogel alginate oxi hóa -gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa -gelatin/BCP tạo khoảng cƣ trú cho tế bào dịch chuyển và lƣu thông các yếu tố chuyển hóa tạo xƣơng. Ngồi ra, tế bào và mạch máu có thể phát triển bên trong các lỗ xốp của vật liệu giúp xƣơng phát triển bên trong vật liệu [83, 84]. Do đó, cấu trúc xốp của hydrogel và hydrogel composite phù hợp cho ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng.
Phân tích cấu trúc pha của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Hình 3.10: Giản đồ XRD của hydrogel alginate oxi hóa và hydrogel
composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP A (77%HAp: 23% β-TCP); B ((66%HAp: 34% β-TCP); C ((21% HAp: 79% β-TCP)
Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X đƣợc dùng để phân tích thành phần pha của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa- gelatin/BCP. Giản đồ nhiễu xạ tia X của hydrogal composite ngoài sự xuất hiện các tín hiệu của tinh thể gelatin, alginate còn xuất hiện các tín hiệu của HAp 31,86 (211); 32,20 (112); 32,90 (300); 34,22 (310); 46,69 (222); 49,51 (320); 53,27 (411).
Hình 3.11: Phổ FTIR cuả gelatin, alginate oxi hóa, hydrogel alginate oxi hóa-
gelatin và hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP
Phƣơng pháp phân tích FTIR dùng để xác định cấu trúc của hydrogel và hydrogel composite dựa trên dao động của các liên kết. Phổ FTIR của alginate oxi hóa xuất hiện các dao động đặc trƣng của polysaccharide 1316 cm (C–O), 1116 cm (C–C), 1025 cm (C–O–C) và 948 cm (C–O) [85, 86]. Dao động 1617 and 1416 cm là dao động của nhóm carboxylate trên alginate [87]. Phổ FTIR của gelatin thể hiện các dao động đặc trƣng của cấu trúc protein nhƣ dao động tại 1636 and 1550 cm là dao động của nhóm N–H [88, 89].
Phổ FTIR của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin có những dao động của alginate oxi hóa, gelatin và dao động của nhóm C=N tại 1648 và 1545 do phản ứng Schiff's base của alginate oxi hóa và gelatin [90, 91]. Phổ FTIR của hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP ngồi những dao động của hydrogel alginate oxi hóa-gelatin cón xuất hiện dao động của PO43- tại 473, 567, 603, 962 and 1037 cm-1.
Nội dung 2: Vô trùng vật liệu
Vô trùng là tiêu diệt tất cả các loài vi sinh vật kể cả dạng sinh dƣỡng và bào tử, các nang ký sinh trùng và các siêu vi trùng. Sử dụng phƣơng pháp chiếu xạ gamma để vô trùng vật liệu (phụ lục 3).
Hiệu lực của quá trình khử trùng dụng cụ y tế bằng chiếu xạ đƣợc đánh giá dựa trên tài liệu ISO- 11137. Liều khử trùng bằng chiếu xạ đƣợc xác định theo tiêu chuẩn