CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.2. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh
Xác định tác nhân gây bệnh theo chu trình Koch kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tên nấm
2.5.2.1. Phân lập nấm Phytophthora:
- Phân lập nấm từ mẫu bệnh: Mẫu bệnh được rửa dưới vòi nước chảy, để khơ trong phịng thí nghiệm. Cắt mẫu thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm (bao gồm cả mô bệnh và mô khỏe), Ngâm trong nước javen 2 phút, sau đó rửa bằng cồn 70°trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng rồi đặt vào môi trường PSM. Khi tản nấm đã phát triển với kích thước 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường PDA.
Theo dõi sự phát triển của tản nấm, thời gian hình thành bọc bào tử, mơ tả hình thái bọc bào tử, sợi nấm...
- Phân lập nấm từ mẫu đất: Sử dụng phương pháp mồi bẫy cánh hoa hồng của Erwin & Ribeiro, 1996.
+ Cho đất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi đạt 3/4 cốc chiều cao. Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thuỷ tinh, để lắng trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm).
+ Cắt cánh hoa hồng có kích thước 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) và thả nhẹ vào cốc nước làm mồi bẫy, để cốc qua đêm ở nhiệt độ 20-25°C.
+ Sau 1, 2 và 3 ngày, khi cánh hoa bị mất màu, quan sát bào tử nang của nấm
Phytophthora dưới kính hiển vi
+ Phân lập và làm thuần nấm như phương pháp phân lập từ mẫu mô cây bị bệnh.
2.5.2.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo * Lây bệnh nhân tạo trên quả:
Quả cam Trưng Vương chín sinh lý được dùng để lây bệnh. Quả được khử trùng bề mặt bằng NaClO 1%, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng.
Dung dịch nấm có mật độ 2 x 105 cfu/ml, nhúng miếng vải màn kích thước 1x1cm vào dung dịch nấm áp lên bề mặt quả, 1 miếng/quả. Dùng băng dính đính miếng vải trên bề mặt vỏ. Quả đối chứng sử dụng nước cất vô trùng. Các quả đã lây nhiễm và đối chứng được đặt trong điều kiện ẩm độ, nhiệt độ 25-280C, trong bóng tối hồn toàn từ 5 đến 7 ngày. Quan sát hàng ngày và ghi nhận, mô tả sự phát triển của bệnh.
* Lây bệnh trên cây con:
Lây bệnh cho cây con bằng cách lây trên thân cây và tưới vào gốc cây. Cây cam Trưng Vương 12 tháng tuổi ghép trên gốc chấp được trồng trong chậu chứa hỗn hợp đất phù sa, mùn và trấu khử trùng đặt ở nhiệt độ 25-280C, nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA. Thân cây được khử trùng bằng cồn 700, lật phần vỏ cây đường kính 5mm, áp miếng thạch có chứa nấm 5 ngày tuổi áp lại miếng vỏ (Alvarez và cs. 2008). Nhỏ 1 giọt nước cất vơ trùng và quấn kín bằng giấy parafilm, bao bằng giấy thiếc để hạn chế sự thoát hơi nước của miếng thạch. Dung dịch nấm Phytophthora được tưới vào các cây thí nghiệm, chăm sóc và tưới ẩm hàng ngày bằng máy phun sương. Cây đối chứng sử dụng miếng thạch (PDA) khơng có nấm.
Thí nghiệm được thực hiện với 10 mẫu nấm mỗi mẫu lây bệnh cho 10 cây. Quan sát, ghi nhận và mô tả vết bệnh sau 30 ngày lây nhiễm.
- Phân lập nấm từ các cây lây bệnh
Quả và cây sau khi xuất hiện vết bệnh sẽ được mô tả triệu chứng, tái phân lập nấm So sánh triệu chứng của cây bị bệnh tự nhiên và cây lây bệnh nhân tạo, hình thái nấm từ vết bệnh ngoài tự nhiên và mẫu nấm qua lây bệnh nhân tạo.
2.5.2.3. Phương pháp xác định loài nấm Phytophthora
- Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái học
Việc xác định lồi Phytophthora dựa vào hình thái của bọc bào tử (sporang), núm (papilla), các cấu trúc sinh sản hữu tính như bao đực, bao trứng, bào tử trứng (oospore) theo khóa phân loại của Drenth, Sendall (2001), Erwin và Ribeiro (1996).
- Xác định loài Phyophthora bằng phương pháp PCR + PCR và giải trình tự
Mẫu nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA (2.3.1.1) trong 5 ngày. DNA được tách chiết từ các mẫu nấm đã nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). Lấy 0,1 g đến 0,2 g sinh khối nấm vào ống eppendorf dung tích 1,5ml có chứa 700 µl dung dịch đệm CTAB 2% (0,1 M Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 2% CTAB, 100µg protease K, bổ sung 0,4% β- mecaptoethanol trước khi sử dụng). Ủ dịch ở 65°C trong 45 phút, lắc nhẹ bằng cách đảo ngược sau mỗi 15 phút. Cho 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1) vào ống và lắc nhẹ trong 1 phút. Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút và lấy 600 µl phần dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1). Lặp lại bước này 2 lần. Lấy 500 µl phần dịch nổi chuyển sang ống mới có chứa 700 µl isopropanol lạnh (- 200C); Lắc nhẹ ống bằng cách đảo ngược và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ phần chất lỏng bên trên, rửa kết tủa DNA bằng 700 µl ethanol 70%. Làm khô cặn DNA trong 30 phút và hòa cặn DNA với 100 µl đệm TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) và bổ sung 5 µl ribonuclease (RNAse 10 mg/ml) vào mỗi ống; đặt các ống trong tủ định ôn ở nhiệt độ 370C trong 1 h, sau đó lưu giữ ở nhiệt độ -200C.
Phản ứng PCR. Hai mồi ITS4 và ITS5 (White và cs., 1990) đã được sử dụng để nhân
ITS4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 52°C. Phản ứng PCR được thiết lập với tổng thể tích 25 µl với các thành phần: 2 µl DNA (xấp xỉ 1-100 ng), 2,5 µl 10X Taq Buffer, 2,5 µl dNTP (200 µM), 1 µl cho mỗi primer (10 µM), 2,5 µl Mg2+ (25 mM), 0,1 µl Taq (5 units/µl) và nước cất 2 lần. Phản ứng khuếch đại PCR với chu trình gia nhiệt như sau: phá vỡ cấu trúc DNA ban đầu ở nhiệt độ 940C trong 4 phút, 35 vòng khuếch đại cấu trúc ở nhiệt độ 940C trong 1 phút, ủ ở nhiệt độ 540C trong 1 phút, 720C trong 1,5 phút, sau 35 vòng, ủ thêm mẫu ở nhiệt độ 720C trong 10 phút, duy trì nhiệt độ ở 40C. Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose. Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR tại Viện Cơng nghệ sinh học tại Hà Nội. Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
+ Phân tích trình tự: Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
Các trình tự được căn trình tư đa chuỗi bằng phần mềm Clustal X ver. 2.0 (Larkin và cs., 2007). Cây phả hệ được phân tích bằng phần mềm MEGA X (Kumar và cs., 2018).