- Là nghiên cứu mô tả cắt ngang tiến cứu
2.3.6. Kỹ thuật PCR( Được thực hiện tại Labo vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương do
Trung ương do Tiến sỹ Nguyễn Văn Hưng – Trưởng khoa chỉ đạo).
2.3.6.1. Nguyên lý:
PCR là kỹ thuật nhân một trình tự AND đích đặc hiệu cho M. Tuberculosis trong một chuỗi các chu kỳ tổng hợp AND gồm 3 giai đoạn:
- Biến tính ( 94◦C). - Lai ghép ( 65◦C). - Tổng hợp ( 72◦C).
Lặp lại với sự trợ giúp của men AND Polymerase chịu nhiệt, các đoạn mồi Oligonucleotid đặc hiệu với các Deoxynucleotid Triphosphat (DNTP). AND Polymerase là men có nhiệm vụ sao chép AND trong quá trình sinh sản tế bào, nó cũng có thể tái sao chép nhiều lần mảnh AND nếu được kích thích đặc hiệu. Bằng cách sử dụng một AND Polymerase đặc hiệu như Taq polymerase và các chất cơ sở cần thiết cho tổng hợp AND, người ta có thể nhân lên tới triệu lần một mảnh AND mà ta muốn phát hiện như gen GroE đối với trực khuẩn lao, sau khi chuỗi đích được khuyếch đại, vào lúc này có thể phát hiện bằng lai tạo với mẫu dò gien [19].
2.3.6.2. Thực hiện kỹ thuật[36,57]
* Chuẩn bị mẫu: 5ml dịch rửa phế quản phế nang vô trùng.
* Sử lý mẫu: Dùng Guadinium thionyanate (GuSCN) để ly giải tế bào và bất hoạt men Nuclease, bộc lộ AND và tách lọc chúng bằng gắn lên các hạt Silica hoặc diatom.
* Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Pha dung dịch hỗn hợp phản ứng gồm: 4 loại nucleotid (2µM), 2 đoạn AND mồi (0,2 µM/mỗi đoạn), men AND Polymerase (1U/50µL), trong dung dịch đệm Tris HCL (10mM Tris HCL và 50 mM NaCL) có chứa MgCL2 (2 µM), Uracil AND Glycosylate (UNG) được cho thêm vào hỗn dịch để chống nhiễm.
Trình tự 2 đoạn mồi: INS2: 5’-GCGTAGGCGTTCGGTGACAAA-3’. Pt8:5’-GTGCGGATGGTCGCAGAGAT- 3’.
* Phản ứng PCR được thực hiện trong 40 chu trình, mỗi chu trình gồm 3 giai đoạn phản ứng:
- Giai đoạn biến tính: 94◦C×1,5’ - Giai đoạn lai ghép: 65◦C×2’
- Giai đoạn tổng hợp: 72◦C×3’
Và chạy điện di để phát hiện sản phẩm PCR trên gien Agarose 2% trong đệm TBE (Tri 0,89 M, axit Boric 0,89M, EDTA 0,02M) với cường độ dòng điện 2-3 V/cm², chụp ảnh bằng tia huỳnh quang.
* Đánh giá kết quả: Do PCR có độ nhậy cao (Phát hiện 10fg tương đương 1-3 vi khuẩn) nên kết quả phải phân tích, đánh giá so với chứng âm( chỉ có dung dịch hỗn hợp phản ứng) và chứng dương ( AND của M. Tuberculosis ), mỗi bệnh phẩm đầu được kiểm tra yếu tố ức chế bằng cách chạy PCR với 2 ống: ống a chứa 10 bệnh phẩm đã sử lý, ống b chứa 5 bệnh phẩm đã xử lý + 5 AND của M.Smegmatis. Kết quả là dương tính nếu 2 ống a và b đều dương tính, kết quả âm tính nếu ống a âm tính, ống b dương tính, bệnh phẩm có chất ức chế nếu cả hai ống a và b đều âm tính( không có vạch đặc hiệu).