CHƢƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.2.1. Phương phỏp phõn tớch định lượng bằng phổ hồng ngoại kết hợp
toỏn hồi quy đa biến
Bƣớc 1: Phƣơng phỏp khảo sỏt xỏc định cỏc điều kiện thớch hợp
Dựa vào cỏc yếu tố ảnh hƣởng đến tớn hiệu đo phổ hồng ngoại (mục 1.4.1.3) và điều kiện phũng thớ nghiệm hiện cú để lựa chọn khảo sỏt cỏc yếu tố ảnh hƣởng bao gồm: khảo sỏt lựa chọn vựng đo phổ hấp thụ hồng ngoại của cỏc hoạt chất, khảo sỏt ảnh hƣởng của tỏ dƣợc, khảo sỏt tỉ lệ khối lƣợng mẫu/KBr, khảo sỏt khối lƣợng mẫu đem ộp viờn và độ lặp lại của quỏ trỡnh ộp viờn, đỏnh giỏ ảnh hƣởng của độ ẩm của mẫu.
Khảo sỏt lựa chọn vựng đo phổ hấp thụ hồng ngoại của cỏc hoạt chất:
Lấy cỏc hoạt chất chuẩn gửi đo mẫu tại bộ mụn Vật liệu và bộ mụn Vụ cơ, khoa Húa học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiờn - Đại học Quốc Gia Hà Nội với
vựng hấp thụ hồng ngoại từ 4000 - 400 cm-1.
Lấy 2 mg mỗi hoạt chất và 98 mg KBr nghiền, trộn trong vũng 10 phỳt, cõn 15 mg hỗn hợp sau khi trộn đem đi ộp viờn. Đo mẫu trờn thiết bị Agilent
Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer, dải số súng đo từ 7500cm-1 đến
2800 cm-1. Dựa vào hai kết quả đo trờn hai dải súng 4000-400 cm-1 và 7500- 2800
cm-1 để lựa chọn vựng đo phổ hấp thụ hồng ngoại, làm căn cứ để tiến hành cỏc thớ
nghiệm tiếp theo.
Khảo sỏt ảnh hƣởng của tỏ dƣợc:
So sỏnh cỏc toa thuốc của nhà sản xuất cung cấp đi kốm với sản phẩm thấy rằng cú sự khỏc nhau về tỏ dƣợc trờn cựng một loại thuốc nhƣng khỏc nhà sản xuất. Vỡ vậy, khi lựa chọn tỏ dƣợc để khảo sỏt chọn cỏc tỏ dƣợc thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất cỏc khỏng sinh và xuất hiện lặp lại nhiều trờn cỏc toa thuốc của nhà sản xuất nhằm xõy dựng đƣợc mụ hỡnh hồi quy đa biến xỏc định đồng thời cỏc hoạt chất khỏng sinh cú phần nền khụng quỏ khỏc với mẫu thực tế. Danh mục cỏc tỏ dƣợc dựng để bào chế thuốc viờn và khảo sỏt ảnh hƣởng của cỏc tỏ dƣợc tới t n hiệu của cỏc hoạt chất trong thuốc nhƣ sau:
+ Nhúm sulfamid tỏ dƣợc gồm tinh bột sắn, magie stearat, bột talc, canxi phosphat, maltodextrin.
+ Nhúm penicilin tỏ dƣợc gồm natri glycolat, magie stearat.
+ Nhúm cephalosporin tỏ dƣợc gồm magie stearat, bột talc, natri glycolat, natri lauryl sulfat, lactose.
Lấy lần lƣợt 2 mg từng tỏ dƣợc trộn với 98 mg KBr, nghiền mịn đồng nhất từng mẫu trong cối mó nóo trong 10 phỳt. Lấy 15 mg lƣợng bột vừa nghiền đƣợc cho vào bộ ộp viờn để thu đƣợc mẫu viờn của cỏc tỏ dƣợc, sau đú đem đo phổ hồng ngoại của cỏc mẫu này trong vựng phổ đó đƣợc lựa chọn. Dựa vào phổ hấp thụ hồng
ngoại thu đƣợc lựa chọn cỏc tỏ dƣợc làm nền trong mẫu thuốc tự tạo, xõy dựng mụ hỡnh hồi quy đa biến xỏc định cỏc hoạt chất khỏng sinh.
Khảo sỏt tỉ lệ khối lƣợng mẫu/KBr
Để khảo sỏt lựa chọn tỉ lệ khối lƣợng mẫu/KBr phự hợp tiến hành khảo sỏt với mẫu thuốc chứa một hoạt chất (mẫu thuốc viờn cephalexin - chứa hoạt chất cephalexin 500mg trong một viờn) và mẫu thuốc chứa hai hoạt chất (mẫu thuốc viờn Bisepton - chứa hàm lƣợng sulfamethoxazol 400 mg và trimethoprim 80 mg trờn một viờn). Tiến hành trộn bột thuốc của mẫu thuốc viờn với KBr theo tỷ lệ khối lƣợng mẫu trờn KBr là x/y với x= 1-10 và y = 100- x.
Khảo sỏt khối lƣợng mẫu đem ộp viờn và độ lặp lại của quỏ trỡnh ộp viờn
Lƣợng mẫu ộp viờn ảnh hƣởng đến bề dày viờn, do đú cú ảnh hƣởng trực tiếp độ hấp thụ quang của hoạt chất. Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi cú khảo sỏt lƣợng mẫu đem ộp viờn chứa cefixim trộn lẫn cỏc tỏ dƣợc từ 10 mg, 15 mg, 17 mg và 20 mg và giữ nguyờn cỏc điều kiện đo mẫu khỏc.
Khảo sỏt sự lặp lại của quỏ trỡnh ộp viờn đến phộp đo bằng cỏch trộn hỗn hợp gồm mẫu bột chứa hoạt chất cephalexin và KBr đƣợc cõn theo tỷ lệ khối lƣợng mẫu/KBr đó lựa chọn, nghiền mịn đồng nhất mẫu trong cối mó nóo 10 phỳt. Tiến
hành chuẩn bị cỏc mẫu viờn bằng cỏch ộp lặp lại 5 lần mẫu của hỗn hợp vừa thu đƣợc với cựng một lƣợng mẫu đem ộp viờn phự hợp, đem đo phổ hồng ngoại của từng mẫu này trong vựng phổ đo, ghi lại phổ hấp thụ hồng ngoại của mỗi mẫu thu đƣợc. Cỏc giỏ trị độ lệch chuẩn đƣợc tớnh trong phần mềm Minitab 16.
Nghiờn cứu đỏnh giỏ ảnh hƣởng của độ ẩm của mẫu
Độ ẩm mẫu là một trong những yếu tố quan trọng gõy ảnh hƣởng trực tiếp đến phổ hấp thụ hồng ngoại của cỏc chất. Để khảo sỏt ảnh hƣởng độ ẩm chuẩn bị 2 mẫu tự tạo gồm cefixim và cỏc tỏ dƣợc cú thành phần và khối lƣợng nhƣ nhau. Trong đú, 1 mẫu đƣợc chuẩn bị tại nhiệt độ, độ ẩm của phũng th nghiệm (45%,
30oC) và một mẫu sau khi chuẩn bị với cựng điều kiện với mẫu 1, đƣợc cho vào tủ
sấy (<500
Bƣớc 2: Phƣơng phỏp xõy dựng mụ hỡnh hồi quy để xỏc định cỏc hoạt chất trong thuốc.
Xõy dựng mụ hỡnh hồi quy và kiểm tra độ chớnh xỏc của mụ hỡnh hồi quy
Chuẩn bị 30-45 mẫu tự tạo cú chứa chất phõn t ch và tỏ dƣợc ảnh hƣởng. Nồng độ của cỏc chất phõn tớch đƣợc lấy ngẫu nhiờn dao động trong khoảng 0- 100%. Đem đo cỏc mẫu tự tạo ta thu đƣợc ma trận tớn hiệu tƣơng ứng. Chọn 20-30 mẫu tự tạo làm mẫu chuẩn. Xõy dựng mụ hỡnh hồi quy để xỏc định cỏc hoạt chất trong thuốc từ ma trận độ hấp thụ quang của 20-30 mẫu chuẩnvà ma trận hàm lƣợng cú chứa chất phõn t ch và tỏ dƣợc. Kiểm tra độ chớnh xỏc của mụ hỡnh thụng qua phõn tớch 10-15 mẫu chuẩn kiểm tra. Trờn phần mềm Matlab R2015a, xử lớ số liệu theo 4 thuật toỏn PCR, CLS, ILS và PLS đỏnh giỏ sai số tƣơng đối và cỏc hệ số tƣơng quan để lựa chọn mụ hỡnh phự hợp.
Để thuận tiện cho việc xử lớ mẫu và nghiờn cứu đỏnh giỏ mụ hỡnh, với cỏc hoạt chất khỏng sinh đó đƣợc lựa chọn chỳng tụi dự định lập cỏc mụ hỡnh hồi quy xỏc định cỏc hoạt chất trong thuốc nhƣ sau:
+ Mụ hỡnh xỏc định một hoạt chất khỏng sinh trong thuốc: Xõy dựng 2 mụ
hỡnh xỏc định 2 hoạt chất trong 2 nhúm sulfamid và β-lactam là sulfaguanidin và
cefixim. Từ mụ hỡnh xỏc định một hoạt chất khỏng sinh trong thuốc lập đƣợc xử lớ số liệu và đỏnh giỏ t nh khả dụng của 4 phƣơng phỏp CLS, ILS, PCR, PLS.
+ Mụ hỡnh hồi quy đa biến xỏc định đồng thời cỏc hoạt chất khỏng sinh trong cựng nhúm thuốc: với nhúm thuốc sulfamid, xõy dựng 1 mụ hỡnh xỏc định 3 hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và hoạt chất đi kốm trimethoprim; nhúm penicilin, xõy dựng một mụ hỡnh xỏc định 3 hoạt chất penicilin, ampicilin, amoxicilin; nhúm cephalosporin, xõy dựng 2 mụ hỡnh xỏc định cỏc hoạt chất trong thuốc viờn cephalexin, cefaclor, cefadroxil và cefixim, cefadroxil, 1 mụ hỡnh xỏc định cỏc hoạt chất trong thuốc tiờm cefotaxim và ceftriaxon. Xõy dựng một mụ hỡnh xỏc định đồng thời cỏc hoạt chất khỏng sinh trong thuốc thuộc nhúm penicilin và nhúm cephalosporin là penicilin và cephalexin.
Chƣơng trỡnh mỏy tớnh của cỏc phƣơng phỏp hồi quy đa biến
Phương phỏp bỡnh phương tối thiểu thụng thường (CLS)
* Cỏc bước tớnh toỏn CLS trong phần mềm Matlab R2015a:
- Khởi động phần mềm MATLAB
- Nhập cỏc ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE
+ Nhập ma trận nồng độ X0(mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử
+ Nhập ma trận t n hiệu phõn t ch Y0(mxn) (n là số t n hiệu đo)
+ Nhập t n hiệu phõn t ch Y của mẫu cần định phõn
- Lƣu cỏc dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : CLS.mat. [5, 6]. - Mở một M-file trong cửa sổ EDITOR và viết cỏc cõu lệnh tại đú (cỏc cõu lệnh trong phần mềm Matlab đƣợc in đậm, cỏc dũng bắt đầu bằng % đƣợc dựng để giải th ch):
%Phuong phap CLS:
%Goi cac bien su dung trong phuong phap
load CLS.mat;
%Tinh ma tran he so hoi quy K:
K=inv(X0'*X0)*X0'*Y0 ;
%KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƢƠNG PHÁP:
%Nhap ma tran tin hieu do hap thu quang cua mau kiem tra: Yktra
%Nhap ma tran nong do cua mau ktra: X0ktra
%X0’ là ma trận chuyển vị của ma trận X0
%Tinh nong do mau kiem tra:
Xktra=Yktra*K'*inv(K*K');
% K’ là ma trận chuyển vị của ma trận K
%Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu phuong phap CLS:
Saiso=(X0ktra-Xktra)*100./X0ktra;
%TèM NỒNG ĐỘ CỦA CHẤT TRONG MẪU BẤT Kè %Nhap ma tran tin hieu do hap thu quang cua mau: Y
X=Y*K'*inv(K*K');
- Lƣu lại M-file vừa thực hiện đƣợc và đặt tờn file: CLS
- Gọi hàm M-file vừa viết đƣợc trong cửa sổ COMMAND WINDOW
>> CLS
- Chƣơng trỡnh sẽ tự động thực hiện cỏc lệnh theo yờu cầu và hiển thị kết quả.
- K ch chuột vào giỏ trị Saiso, X trong WORKSPACE thu đƣợc cỏc dữ liệu mong muốn [5, 6, 10].
Phương phỏp bỡnh phương tối thiểu nghịch đảo (ILS)
* Cỏc bước tớnh toỏn ILS trong phần mềm Matlab R2015a:
- Khởi động phần mềm MATLAB
- Nhập cỏc ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE
+ Nhập ma trận hàm lƣợng X0(mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử (m hàng, k cột)
+ Nhập ma trận t n hiệu phõn t ch Y0(mxn) (n là số t n hiệu đo)
+ Nhập t n hiệu phõn t ch Y của mẫu cần định phõn
- Lƣu cỏc dữ liệu vừa nhập vào thành 1 file trong Matlab : ILS.mat [5, 6] - Mở một M-file và viết cỏc cõu lệnh tại đú (cỏc cõu lệnh trong phần mềm Matlab đƣợc in đậm, cỏc dũng bắt đầu bằng % đƣợc dựng để giải th ch):
%Phuong phap ILS:
%Goi cac bien su dung trong phuong phap
load ILS.mat;
%Tinh ma tran he so hoi quy:
P=inv(Y0'*Y0)*Y0'*X0;
%KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƢƠNG PHÁP: %Tinh nong do chat trong mau kiem tra:
Xktra=Yktra*P;
%Tinh sai so giua nong do chuan voi nong do xac dinh duoc tu ILS:
% TÍNH NỒNG ĐỘ CỦA CHẤT TRONG MẪU BẤT Kè %Tinh nong do cua mau:
X=Y*P
- Lƣu lại M-file vừa thực hiện đƣợc: ILS.m
- Gọi M-file vừa viết đƣợc trong cửa sổ COMMAND WINDOW
>> ILS
- Chƣơng trỡnh sẽ tự động thực hiện cỏc yờu cầu mong muốn và trả lại kết quả dƣới dạng ma trận. K ch chuột vào giỏ trị Saiso, X trong WORKSPACE để hiển thị cỏc ma trận số liệu đú [5, 6, 10].
Phương phỏp bỡnh phương tối thiểu từng phần (PLS)
* Cỏc bƣớc tớnh toỏn PLS trong phần mềm Matlab R2015a: - Khởi động phần mềm MATLAB
- Nhập cỏc ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE
+ Nhập ma trận nồng độ Y(mxk) của m mẫu chuẩn chứa k cấu tử (m hàng, k cột)
+ Nhập ma trận tớn hiệu phõn tớch dựng làm mụ hỡnh chuẩn X(mxn) (n là số tớn hiệu đo) của cỏc mẫu chuẩn
+ Nhập tớn hiệu phõn t ch dựng để đỏnh giỏ t nh đỳng của mụ hỡnh chuẩn Xtest của mẫu chuẩn
+ Nhập t n hiệu phõn t ch của cỏc mẫu thực Xsam của mẫu cần định phõn. Mở cửa sổ COMMAND WINDOW và chạy cỏc cõu lệnh tại đú:
+Tinh so laten variable, chon so component (n < so mau) [XL,YL,XS,YS,BETA,PctVar] = plsregress(X,Y,n); >> plot(1:n,cumsum(100*PctVar(2,:)),'-bo');
xlabel('Number of PLS components'); ylabel('Percent Variance Explained in Y'); +Chay lai vo so n thich hop
“Xtest la ma tran tin hieu kiem chung mo hinh
Xsam la ma tran tin hieu mau thuc
Ytest la ma tran nong do mau kiem
chung mo hinh
Ypred la ma tran nong do mau chuan tinh lai dc tu ma tran BETA
Ysam la ma tran nong do mau thuc tinh lai dc tu BETA”
Ypred=[ones(size(X,1),1) X]*BETA; Ytest=[ones(size(Xtest,1),1) Xtest]*BETA; Ysam=[ones(size(Xsam,1),1) Xsam]*BETA;
ôsize(X,1) : cho ra so dong cua ma tran X = so mau
[one(size(X,1),1) X] : them mot ma tran 1 co 1 cot, n hang vao ma tran X ô
+ chọn cửa sổ WORKPACE chọn Ytest để kiểm tra , chọn Ysam để thu đƣợc hàm lƣợng hoạt chất cú trong mẫu [5, 6, 10].
Phương phỏp hồi quy cấu tử chớnh (PCR)
* Cỏc bước tớnh toỏn PCR trong phần mềm Matlab R2015a:
- Khởi động phần mềm MATLAB
- Nhập cỏc ma trận dữ liệu trong cửa sổ WORKSPACE
+ Nhập ma trận nồng độ Y(mx1) của m mẫu chuẩn chứa 1 cấu tử (m hàng, 1 cột).
+ Nhập ma trận tớn hiệu phõn tớch dựng làm mụ hỡnh chuẩn X(mxn) (n là số tớn hiệu đo) của cỏc mẫu chuẩn.
+ Nhập tớn hiệu phõn t ch dựng để đỏnh giỏ t nh đỳng của mụ hỡnh chuẩn Xtest của mẫu chuẩn.
+ Nhập t n hiệu phõn t ch của cỏc mẫu thực Xsam của mẫu cần định phõn. Mở cửa sổ COMMAND WINDOW và chạy cỏc cõu lệnh tại đú:
+ Khai bỏo ma trận X và t nh cỏc hệ số PCAloadings, PCAcores, PCAvar [n,p]=size(X);
[PCALoadings,PCAScores,PCAVar] = pca(X,'Economy',false);
+Tớnh hệ số tƣơng quan của mụ hỡnh chuẩn beta với m là số PC lựa chọn beta = regress(Y-mean(Y), PCAScores(:,1:m));
beta = [mean(Y) - mean(X)*beta; beta]; beta = PCALoadings(:,1:m)*beta; + T nh cỏc giỏ trị Ypred, Ytest, Ysam
Ypred là ma trận nồng độ mụ hỡnh chuẩn tớnh lại được với hệ số tương quan BETA Ytest là ma trận nồng độ cỏc mẫu kiểm tớnh lại được với hệ số tương quan BETA Ysam là ma trận nồng độ cỏc mẫu thực tớnh lại được với hệ số tương quan BETA
Ypred = [ones(n,1) X]*beta;
Ytest= [ones(size(Xtest,1),1) Xtest]*beta; Ysam=[ones(size(Xsam,1),1) Xsam]*beta;
+ Nếu xỏc định đồng thời nhiều cấu tử thỡ ta chạy cõu lệnh với từng cấu tử sau đấy tổng kết quả lại theo cỏc cõu lệnh.
Ypred=[Ypred_1,Ypred_2,Ypred_3]; Ytest=[Ytest_1,Ytest_2, Ytest_3]; Ysam=[ Ysam_1,Ysam_2,Ysam_3];
Với Ypred_1, Ypred_2, Ypred_3, Ytest_1, Ytest_2, Ytest_3, Ysam_1, Ysam_2, Ysam_3 là cỏc ma trận nồng độ t nh đƣợc của cỏc cấu tử 1, 2 và 3
+ Chọn cửa sổ WORKPACE chọn Ypred, Ytest để kiểm tra, chọn Ysam để thu đƣợc hàm lƣợng hoạt chất cú trong mẫu [5, 6, 10].
Bƣớc 3: Phƣơng phỏp phõn tớch mẫu thực tế
Phõn tớch mẫu thực tế trờn cơ sở vecto số liệu độ hấp thụ quang của một mẫu và mụ hỡnh đa biến tuyến t nh đó chọn.
T nh toỏn hàm lƣợng hoạt chất trong cỏc mẫu thuốc viờn theo cụng thức dƣới đõy:
( / ờ ) tb t X m HL mg vi n m
Trong đú:
X: Lƣợng (mg) hoạt chất tỡm đƣợc từ mụ hỡnh hồi qui đa biến
mt: Khối lƣợng cõn của mẫu thử (mg)
mtb: Khối lƣợng trung bỡnh của 1 viờn của thuốc (mg)