Dung dịch cỏc β-lactam khụng bền ở pH>8 hoặc <5. Do đú cần bảo quản
chỳng ở pH 5,5 - 6,8 bằng cỏc hệ đệm citrat, phosphat. Cỏc ion citrat và phosphat cũn cú vai trũ tạo muối khú tan với cỏc cation kim loại Zn, Ca, Cd, Cu làm giảm vai trũ xỳc tỏc thủy phõn của cỏc cation này.
Phản ứng với tỏc nhõn ỏi nhõn
Cỏc penicilin phản ứng với ancol, amin tạo este hoặc amid của acid
penicilloic, với hydroxylamin tạo acid hydroxamic [11] (hỡnh 1.9), với Fe3+ cho màu
đỏ. Cỏc ion kim loại khỏc (Zn2+, Cd2+, Pb2+, Hg2+) xỳc tỏc phản ứng thủy phõn [8].
Hỡnh 1.9: Phản ứng giữa penicilin với hydroxylamin, Cu2+
N S CH3 CH3 COOH N C R 1 2 3 4 5 6 7 O H O H N HS CH3 CH3 COOH N R 1 2 3 4 5 6 7 O O 1 N S CH3 CH3 COOH 1 2 3 4 5 6 7 1 N HOOC R Acid penillic N O S CH3 CH3 COOH H N C O R 1 2 3 4 5 6 7 NH2OH HN S CH3 CH3 C H N C O R 1 2 3 4 5 6 7 NH O OH O OH Cu++ HN S CH 3 CH3 C H N C O R 1 2 3 4 5 6 7 NH O O O O Acid hydroxamic Cu Hydroxamat đồng (xanh)
1.1.2.3. Độc tớnh và tai biến của β- lactam
Cỏc khỏng sinh nhúm penicilin rất t độc, gõy tai biến chủ yếu do dị ứng, gõy ngứa và nổi mề đay, dị ứng nặng gõy sốc phản vệ, cú thể xảy ra với ngƣời dựng thuốc lần đầu, nhƣng thƣờng xảy ra nhất với những ngƣời dựng thuốc nhiều lần, ớt xảy ra ở trẻ em [1, 8].
1.2. Cỏc phương phỏp phõn tớch định tớnh cỏc hoạt chất khỏng sinh trong thuốc
Phương phỏp sắc ký lớp mỏng (theo dược điển Việt Nam 4 [2])
Phƣơng phỏp sắc ký lớp mỏng định tớnh cỏc hoạt chất nhúm sulfamid (dạng
viờn nộn) dựng bản mỏng silica gel GF254. Dung mụi khai triển là dicloromethan-
methanol- acid formic khan (70:20:10) đối với sulfaguanidin, cloroform - methanol - dimethylformamid (20 : 2 : 1), hoặc cloroform - methanol (19 :1) đối với sulfamethoxazol, heptan - cloroform - dung dịch methanol 5 % (v/v) trong ethanol - acid acetic bằng tỷ lệ (4 : 4 : 4 : 1) đối với sulfadoxin (viờn nộn chứa sulfadoxinvà pyrimethamin). Dung dịch thử và dung dịch đối chiếu của sulfaguanidin đƣợc pha trong aceton, sulfamethoxazol và sulfadoxin đƣợc pha trong methanol. Tiến hành chấm riờng biệt lờn bản mỏng mỗi dung dịch trờn. Triển khai sắc ký, sau đú lấy bản mỏng ra để khụ ngoài khụng kh . Quan sỏt dƣới ỏnh sỏng tử ngoại ở bƣớc súng 254 nm. Hai vết ch nh trờn sắc ký đồ của dung dịch thử phải phự hợp với hai vết ch nh trờn sắc ký đồ của cỏc dung dịch đối chiếu về vị tr và màu sắc [2].
Để định t nh cỏc hoạt chất cephalosporin bằng phƣơng phỏp sắc ký lớp mỏng ta dựng bản mỏng là Silica gel F254 đó đƣợc silan húa. Dung mụi khai triển gồm cú dung dịch acid citric 0,1 M - dung dịch dinatri hydrophosphat 0,1 M - dungdịch ninhydrin trong aceton cú nồng độ 1 g trong 15 ml (60 : 40 : 1,5) đối với cefadroxil, methyl acetat - dung dịch amoni acetat 15,4 % đó đƣợc điều chỉnh trƣớc tới pH 6,2 bằng acid acetic (10 : 90) đối với cefixim, aceton - dung dịch amoni acetat 15,4% đó đƣợc điều chỉnh trƣớc tới pH 6,2 bằng acid acetic (15 : 85) đối với cefotaxim. Dung dịch thử và dung dịch đối chiếu của cefadroxil hũa tan trong nƣớc, cũn với cefixim sử dụng dung mụi pha mẫu(dung dịch A) là hỗn hợp methanol - dung dịch đệm phosphat 0,067 M pH 7,0 (1 : 1), cefotaxim sử dụng mụi pha mẫu (dung dịch A): Hỗn hợp methanol - dung dịch đệm phosphat 0,067 M pH 7,0 (1 : 1). Sau đú, chấm riờng biệt lờn bản mỏng mỗi dung dịch trờn. Triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để
khụ và quan sỏt dƣới ỏnh sỏng tử ngoại ở bƣớc súng 254 nm. Vết ch nh thu đƣợc trờn sắc ký đồ của dung dịch thử phải phự hợp về vị tr , k ch thƣớc với vết chớnh trờn sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). Phộp thử chỉ cú giỏ trị khi sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) cho 2 vết tỏch rừ ràng [2].
Phương phỏp định tớnh cefaclor: Thời gian lƣu của pic ch nh trong sắc ký đồ
ở phần định lƣợng của dung dịch thử phải tƣơng đƣơng với thời gian lƣu của pic ch nh thu đƣợc từ sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Lấy khoảng 2 mg chế phẩm cho vào một ống nghiệm cú chiều dài 15 cm và đƣờng k nh 1,5 cm. Làm ẩm bằng một giọt nƣớc, thờm 2 ml dung dịch formaldehyd trong acid sulfuric (TT). Quay trũn ống nghiệm để trộn đều, dung dịch phải khụng màu. Đặt ống nghiệm vào trong, cỏch thủy sụi 1 phỳt, dung dịch chuyển thành màu nõu vàng [2].
Với nhúm penicilin, định tớnh bằng phƣơng phỏp sắc ký lớp mỏng trờn bản mỏng (pha tĩnh) là silicagel H đó đƣợc silan hoỏ. Đối với penicilin, pha động là hỗn hợp của dung dịch amoni acetat 15,4% và aceton (TT) (70 : 30), đƣợc điều chỉnh tới pH 5,0 bằng acid acetic khan (TT), pha động là hỗn hợp của dung dịch amoni acetat 15,4% và aceton (TT) (90 : 10) đƣợc điều chỉnh tới pH 5,0 bằng acid acetic khan (TT) với amoxicilin và ampicilin. Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch đối chiếu cho ampicilin với dung mụi là dung dịch natri hydrocarbonat 4,2%. Sau khi triển khai sắc ký, để khụ bản mỏng ngoài khụng kh , đặt bản mỏng vào bỡnh cú hơi iod cho đến khi xuất hiện cỏc vết. Quan sỏt cỏc vết dƣới ỏnh sỏng ban ngày. Trờn sắc ký đồ, vết ch nh thu đƣợc của dung dịch (1) phải tƣơng ứng về vị tr , màu sắc và k ch thƣớc với vết thu đƣợc của dung dịch (2). Phộp thử chỉ cú giỏ trị khi trờn sắc ký đồ dung dịch (3) tỏch ra 2 vết rừ ràng, riờng biệt [2].
Phản ứng định tớnh với cỏc thuốc thử
Phản ứng với H2SO4- formaldehyd: Tựy thuộc vào từng loại mà phản ứng định
tớnh cho cỏc màu sắc khỏc nhau. Cefixim phản ứng với H2SO4- formaldehyd cho
màu vàng, chuyển thành cam khi đun cỏch thủy; Cefadroxil cho màu vàng, chuyển sang màu da cam khi cỏch thủy; Amoxicilin hầu nhƣ khụng màu, chuyển thành vàng sẫm khi đun cỏch thủy; Ampicilin hầu nhƣ khụng màu, chuyển thành vàng sẫm khi đun cỏch thủy; Benzylpenicilin kali hầu nhƣ khụng màu, chuyển thành màu nõu đỏ
khi đun cỏch thủy; Cefaclor hầu nhƣ khụng màu, chuyển thành vàng nõu khi đun cỏch thủy; Cefotaxim màu vàng sỏng, chuyển thành nõu khi đun cỏch thủy; Cephalexin màu vàng nhạt, chuyển thành vàng sẫm khi đun cỏch thủy [2].
Phƣơng phỏp phổ hồng ngoại
Phƣơng phỏp phổ hồng ngoại cho phộp nhận dạng sự xuất hiện và cú mặt của cỏc nhúm chức đặc trƣng [9]. Cụ thể, phổ IR xỏc định đƣợc sự cú mặt nhúm amin bậc
một -NH2 trong vựng từ 3400-3250 cm-1, amin bậc hai >NH trong vựng từ 3350-
3310 cm-1, chức >SO2 ở giữa 1370- 1310 cm-1 (đối với dao động húa trị bất đối xứng)
và 1180- 1120cm-1 (đối với dao động húa trị đối xứng), nhõn thơm trong vựng 1625-
1430 cm-1. Để định tớnh cỏc mẫu thuốc, tiến hành đo phổ IR của cỏc mẫu thử sau đú
so sỏnh với phổ IR của mẫu chuẩn trong cỏc thƣ viện phổ tham chiếu [2, 3].
1.3. Cỏc phương phỏp phõn tớch định lượng cỏc hoạt chất khỏng sinh trong thuốc
1.3.1. Phương phỏp điện húa
Một số phƣơng phỏp điện húa đó đƣợc ứng dụng để phõn tớch cỏc β-lactam
nhƣng khụng phổ biến nhiều. Phƣơng phỏp cú t nh chọn lọc cao, giới hạn phỏt hiện thấp, độ ch nh xỏc cao nhƣng khú ứng dụng trong phõn t ch đồng thời.
Cỏc nghiờn cứu định lƣợng hoạt chất khỏng sinh nhƣ cefadroxil [14], cefaclor [98], cefotaxim [123] đƣợc tiến hành trờn điện cực màng thủy ngõn, xỏc định cephalexin [35, 121], penicilin [107] trờn điện cực màng kim cƣơng, xỏc định amoxicilin [41] bằng điện cực than thủy tinh biến tớnh bằng glutaraldehyd. Ngoài ra, cú thể xỏc định đồng thời glutathion và cephalexin bằng điện cực màng kim cƣơng - boron [35], xỏc định đồng thời cỏc cephalosporin bằng phƣơng phỏp phõn t ch phõn cực [89]. Cỏc thớ nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện tối ƣu cú pH, đệm, điện thế xỏc định. Kết quả phõn tớch cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối vào khoảng 1,5% -
4,2%, khoảng tuyến tớnh ở nồng độ từ 10-7-10-9 mol/l.
1.3.2. Phương phỏp điện di mao quản
Phƣơng phỏp đó đƣợc ứng dụng để tỏch và xỏc định cỏc khỏng sinh β- lactam trong nhiều đối tƣợng khỏc nhau đặt biệt là cỏc mẫu sinh học. Phƣơng phỏp cú độ thu hồi cao, giới hạn phỏt hiện thấp, độ lệch chuẩn thấp nhƣng việc chuẩn bị mẫu khỏ phức tạp [24, 91, 96].
Cỏc nghiờn cứu cho thấy cú thể ỏp dụng phƣơng phỏp CE để phõn tớch riờng lẻ (amoxicilin [44]) và đồng thời cỏc hoạt chất khỏng sinh (nafcilin, dicloxacilin, cloxacilin, oxacilin, ampicilin, penicilin G và amoxicilin; cephazolin, cefuroxim natri, ceftriaxon natri, cefoperazon natri và ceftaidim [23, 91, 96]) trờn cỏc đối tƣợng nhƣ nƣớc [22], nƣớc tiểu ngƣời [26], trong chất thải, nƣớc sụng [24]. Cỏc kỹ thuật chủ yếu là điện di mao quản vựng (CZE) và điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC). Kết quả cho thấy hệ số tƣơng quan lớn 0,94- 0,99%, độ lệch chuẩn tƣơng đối nhỏ <10%, giới hạn phỏt hiện thấp (àg/L).
1.3.3. Phương phỏp sắc kớ lỏng hiệu năng cao
Phƣơng phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phƣơng phỏp phổ biến cú khả năng tỏch và định lƣợng đồng thời cỏc chất cú độ phõn cực gần nhau, cú độ ch nh xỏc, độ nhạy cao, giới hạn phỏt hiện thấp đƣợc ỏp dụng rộng rói để xỏc định cỏc hoạt chất khỏng sinh trong cỏc sản phẩm dƣợc phẩm. Tuy nhiờn cú nhƣợc điểm thiết bị đắt tiền, tốn dung mụi, thời gian làm sạch và ổn định sau mỗi lần chạy lõu.
Theo dƣợc điển Việt Nam và dƣợc điển Mỹ [2, 111] cỏc hoạt chất khỏng sinh trong nhúm sulfamid đƣợc xỏc định bằng phƣơng phỏp sắc ký lỏng với pha động là hỗn hợp của 700ml nƣớc, 200ml Acetonitril và 1ml triethylamin. Điều kiện sắc ký
gồm cột thộp khụng gỉ (30 cm ì 3,9 mm) đƣợc nhồi pha tĩnh B (5 m) với detector
quang phổ tử ngoại đặt ở bƣớc súng 230 nm, tốc độ dũng là 2,0 ml/phỳt, thể t ch tiờm mẫu 20 l (dƣợc điển Việt Nam) [2] và cột C18 (250 x 4,6 mm; 5àm), detector UV 254 nm, tốc độ dũng là 1,8 ml/ phỳt, thể t ch tiờm 20 àl (dƣợc điển Mỹ) [111]. Nhúm tỏc giả Cemal Akay, Sibel A. Ozkan [33] đó tiến hành nghiờn cứu thành cụng quy trỡnh định lƣợng sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứa sulfamethoxazol và trimethoprim) theo phƣơng phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao với pha động là hỗn hợp của methanol và nƣớc (60: 40) điều chỉnh đến pH=3,0 bằng acid phosphoric 10
%. Điều kiện sắc ký gồm cột C18, detector quang phổ tử ngoại đặt ở bƣớc súng 213
nm, tốc độ dũng 1,8 ml/min, thể t ch tiờm 10 l. Khoảng tuyến t nh của phƣơng
phỏp là từ 2,0-10,0 àg/ml đối với trimethoprim và từ 10,0- 50,0 0 àg/ml đối với sulfamethoxazol. Giới hạn phỏt hiện tƣơng ứng với trimethoprim và sulfamethoxazol lần lƣợt là 0,45 và 1,21 àg/ml [33].
Đối với cỏc hoạt chất khỏng sinh β-lactam cú thể định lƣợng đƣợc riờng lẻ
(ampicilin [29, 109], cefaclor [37], cefadroxil [67]) và định lƣợng đồng thời (amoxicillin và clavulanic [13], cephalexin và carbocistein [12], cefixim và cloxacilin [16], cefotaxim natri và paracetamol [28], amoxicilin, ampicilin, oxacilin, cloxacilin và cephapirin [34], cefixim, cefaclor, cefadroxil, cephalexin, cephradin [82] và cỏc hoạt chất khỏng sinh khỏc trong nhúm [27, 62, 79, 109, 114]…) bằng phƣơng phỏp HPLC trờn cỏc đối tƣợng khỏc nhau nhƣ huyết tƣơng [119], sữa bũ khụ đó chế biến [117], cỏc mẫu nƣớc, mẫu dƣợc phẩm, nƣớc tiểu chuột, cỏc mụ cơ bắp [63]. Sử dụng cỏc phƣơng phỏp RP-HPLC [12, 13], HPLC [104], LC/MS [27, 28], UPLC-MS/MS [37], LC-MS/MS[66], HPLC/UV [93], LC-UV/DAD [48], với pha động chủ yếu là đệm acetat, acid formic dung dịch (0,05%) và methanol ở tỷ lệ 45: 55, dihydrogen phosphat (pH 3,5) -acetonitril (87,5: 12,5, v / v), 0,1% acid formic và acetonitril. Cỏc cột thƣờng dựng là C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm), C8, Polar-RP 80A.... kết quả cho thấy rằng phƣơng phỏp HPLC cú độ phỏt hiện thấp từ 0,05 -0,5àg/ml và độ ch nh xỏc <15%.
1.3.4. Phương phỏp phổ tử ngoại khả kiến
Phƣơng phỏp phổ tử ngoại khả kiến là phƣơng phỏp phõn t ch dựa trờn t nh chất quang học của chất cần phõn t ch. Cỏc phƣơng phỏp này đơn giản dễ tiến hành thụng dụng đƣợc ứng dụng nhiều khi xỏc định cỏc β-lactam và sulfamid ở dạng hoạt chất tinh khiết và trong dƣợc phẩm.
Phƣơng phỏp đƣợc ứng dụng để định lƣợng một số cỏc hoạt chất khỏng sinh riờng lẻ. Xỏc định cephalexin [17] đƣợc thực hiện bằng phƣơng phỏp UV- Vis và phƣơng phỏp quang phổ hấp thụ nguyờn tử khi hoạt chất tạo phức với Fe(III) trong điều kiện pH= 1-8 điều kiện tốt nhất là pH=2. Để định lƣợng amoxicilin [117]
ngƣời ta cho tạo phức với acid p-amino benzoic hoặc diazo húa trong mụi trƣờng
kiềm, phƣơng phỏp cú LOD từ 0,1877 àg/ml đến 0,1916 àg/ml.
Một số cụng trỡnh nghiờn cứu cũng chỉ ra rằng cú thể sử dụng phƣơng phỏp phổ tử ngoại khả kiến để xỏc định đồng thời cỏc hoạt chất khỏng sinh trong nhúm sulfamid [86, 90, 122] và nhúm β-lactam [54, 55, 56, 101]. Định lƣợng cỏc sulfamid bằng cỏch đo UV trong khoảng súng 200-350 nm từ một bộ mẫu cú chứa
dung dịch ethanol (pH = 9,9) [86] xử l kết quả thực nghiệm theo 3 mụ hỡnh hồi quy CLS, PCR và PLS xỏc định đƣợc cỏc hoạt chất trong khoảng nồng độ1,0-24,0 mg/l với LOD trong khoảng 0,2-1,0 mg/l. Cú thể định lƣợng cỏc sulfamid dựa trờn sự hỡnh thành của một sản phẩm cú màu đỏ bằng phƣơng phỏp diazo húa [90] xỏc định đƣợc cỏc hoạt chất trong khoảng tuyến t nh 0,04-8,0 àg/ml, hay bằng phƣơng phỏp chuẩn độ giỏn tiếp theo phƣơng phỏp iod [40]. Định lƣợng cỏc cephalosporin trong thuốc bột pha tiờm đƣợc thực hiện bằng cỏch oxi húa tạo hợp chất cú màu với chất thử metol-chromi (VI) [18], muối variamine xanh [31], 4-amino antipyrin [55], prussian xanh [88] trong khoảng nồng đồ tuyến t nh từ 0,2 àg/l đến 8,5 àg/l phƣơng phỏp cú độ chọn lọc và độ ch nh xỏc cao.
Nhƣ vậy, qua cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu ta cú thể thấy rằng sử dụng phƣơng phỏp phổ tử ngoại khả kiến trong phõn t ch cỏc hoạt chất khỏng sinh sulfamid và β- lactam cú ƣu điểm là cho độ ch nh xỏc và độ chọn lọc cao, nhanh. Nhƣợc điểm là chỉ cú thể ỏp dụng với cỏc chất cú t nh chất quang học, khoảng nồng độ tuyến t nh nhỏ và phải sử dụng cỏc chất tạo màu, phải đảm bảo cỏc điều kiện phõn t ch nhƣ pH, dung mụi phự hợp cho cỏc th nghiệm.
1.3.5. Phương phỏp phổ Raman
Hiện tại, về phƣơng diện định lƣợng, phổ Raman chƣa thể hiện đƣợc nhiều thế mạnh so với phổ cận hồng ngoại nờn việc ứng dụng phổ Raman để định lƣợng hầu nhƣ rất t chủ yếu đƣợc ứng dụng về định t nh và xỏc định cấu trỳc chất phõn t ch. Cú thể thấy phổ Raman cũn tồn tại một số vấn đề khiến chƣa thể là phƣơng phỏp định lƣợng đƣợc ứng dụng rộng rói.
Thứ nhất, phổ Raman cú chựm tia nhỏ, chỉ phõn t ch đƣợc trong một diện t ch nhỏ, khụng mang t nh đại diện cao cho mẫu phõn t ch. Trong nhiều trƣờng hợp, khụng thể đồng nhất tuyệt đối mẫu đo đƣợc nờn nhiều khi do vị tr phõn t ch khỏc nhau mà đỏp ứng phổ giữa cỏc lần đo khỏc nhau, đặc biệt là khi đo phổ của cỏc mẫu rắn. Điều này dẫn đến sai số khi phõn t ch dữ liệu để xõy dựng mụ hỡnh định lƣợng bằng cỏc phần mềm toỏn húa.
Thứ hai, muốn định lƣợng đƣợc phổ Raman thỡ sự đồng đều của cỏc mẫu đo cần phải yờu cầu rất cao, nờn phổ Raman thƣờng chỉ cú thể ỏp dụng cho cỏc mẫu
phõn t ch dạng dung dịch mà thụi. Tuy nhiờn, khi phõn t ch dung dịch, hàm lƣợng chất phõn t ch nhỏ nờn yờu cầu thiết bị phải cú độ phõn giải và độ ch nh xỏc cao, kốm theo cỏc điều kiện phõn t ch phải ổn định [50, 102].
Một số nghiờn cứu ứng dụng quang phổ Raman trong phõn t ch dƣợc phẩm đƣợc thống kờ trong bảng 1. 4.
Bảng 1.4: Danh sỏch cỏc dược phẩm được nghiờn cứu bằng phương phỏp quang phổ Raman
Tỏc giả Hoạt chất Quang phổ kế Phõn t ch dữ liệu
E.A.Cutmore, P.W.Skett [50] Amoxycilin, flucloxacilin, cephalothin FT Phõn tớch dữ liệu phổ Lewis EN, Kalasinsky VF, Levin IW [75] nystatin, amphotericin A, amphotericin B FT Đa biến Kontoyannis CG, Orkoula M [73]
Aspirin Tỏn sắc Đơn biến
Sutherland WS, Laserna JJ, Angebranndt MJ, Winefordner JD [106] sulfadiazin, sulfamerazin, sulfamethazin Tỏn sắc Đơn biến Subhashree Sahoo, Chandra Kanti Chakraborti, Subash Chandra Mishra [104] Ciprofloxacin Tỏn sắc Phõn t ch dữ liệu phổ
Sulaf Assi, Robert A. Watt, Anthony C. Moffat [105]
1.4. Phƣơng phỏp phổ hồng ngoại kết hợp với thuật toỏn hồi quy đa biến phõn tớch cỏc hoạt chất khỏng sinh trong thuốc
1.4.1. Nguyờn tắc của phương phỏp đo phổ hồng ngoại
1.4.1.1. Sự xuất hiện của phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phổ của cỏc phõn tử và nhúm phõn tử xuất hiện dƣới tỏc dụng của chựm sỏng k ch th ch cú năng lƣợng phự hợp (tƣơng tỏc khụng đàn hồi) nằm trong vựng hồng ngoại (IR) làm cho cỏc phõn tử , cỏc nhúm phõn tử, nguyờn tử quay và dao động. Cỏc quỏ trỡnh đú sinh ra phổ hấp thụ hồng ngoại của chất dƣới