B LSDA HF LSDA LYP
3.1.1. Nghiên cứu đặc điểm của tâm hoạt động và khe hẹp gn tâm hoạt động SER403 của PBP2a
hoạt động SER403 của PBP2a
Đối tượng được sử dụng để tính tốn là enzym transpeptidase, một protein liên kết penicillin (PBP), trong trường hợp cụ thể là PBP2a, mà tâm hoạt động SER403 có nhóm hydroxyl. Hai kháng sinh β-lactam được chọn nghiên cứu trong luận án, một là dẫn xuất bán tổng hợp từ penicillin (methicillin) và một nữa là dẫn xuất bán tổng hợp từ cephalosporin (nitrocefin). Dữ liệu đầu vào về cấu trúc của các tác nhân phản ứng và các phức hoạt động được chuẩn bị dựa vào protein data bank (PDB). Cơ chế axyl hóa trong đó cacbonyl của β-lactam bị tấn cơng bởi axit amin Ser403 ở tâm hoạt động. Từ cấu trúc của phức sản phẩm được xác định bằng phân tích X- ray mã là 1MWU chúng tôi đã xây dựng các cấu trúc phức khơng cộng hóa trị.
Như phần tổng quan chúng tơi đã trình bày, giai đoạn 1 của tương tác
giữa phối tử và PBP2a là q trình hình thành phức khơng cộng hóa trị. Q trình β-lactam đi vào trong hốc phản ứng và tạo liên kết khơng cộng hóa trị với Ser403 tạo phức michaelis giữa β-lactam và PBP2ạ
N S S O O H N O H3CO OCH3 O H - O SER N H O NH R OH CH2 Ser HN H O NH R O CH2 Ser ...
Hình 3.1. Cơ chế axyl hóa trong đó nhóm (OH) của SER403 trong PBP2a tấn cơng nhóm (CO) cacbonyl của -lactam
Bằng cách phân tích cấu trúc tinh thể các phức axyl và cấu trúc apo, Lim và Strynadka70 đã giả thiết một cơ chế kháng thuốc có thể chấp nhận được, trong đó sự thay đổi cấu trúc tâm hoạt động trong quá trình chuyển từ phức michaelis sang phức trung gian axyl-PBP đòi hỏi một năng lượng lớn để đưa β-lactam vào vị trí axyl hóạ Q trình này đòi hỏi một sự vặn nếp gấp β3 (gồm các axit amin 594-603) với một sự thay đổi thích hợp của xoắn α2 đầu N (bao gồm các axit amin 402-408) với Ser403 cho tấn công ái nhân. Tuy vậy, những tính tốn của chúng tơi trình bày dưới đây chỉ ra rằng bên cạnh tâm hoạt động cịn có mặt một rãnh hoạt động giữa một bên là nếp gấp β3 và một bên là nhóm các axit amin 440-447 được gọi là cuộn Z đóng vai trị quan trọng trong việc tạo thành phức michaelis liên quan đến chất trung gian axyl- PBP.
Chuẩn bị cấu trúc phối tử và protein cho việc tính tốn mơ phỏng
Cấu trúc tinh thể của phân mảnh PBP2a từ MRSA (ký hiệu là PBP2a*) được xác định bởi Lim và Strynadka70
(mã ký hiệu trong ngân hàng dữ liệu protein - Protein Data Bank - PDB là 1VQQ) được chỉ ra trong hình 3.2 và
hình 3.3 có thể chia thành hai mảnh. Mảnh thứ nhất màu nhạt từ axit amin có số thứ tự theo PDB đánh số từ 27 đến 300 và mảnh thứ hai màu đậm từ axit amin 301 đến 668. Tâm gắn kết bao gồm nếp gấp β3 và xoắn α2 đầu N định vị ở cục thứ hai và nằm xa các nguyên tử của mảnh thứ nhất hơn 20 Å. Việc chuẩn bị này để so sánh và minh chứng rằng tác động của các nguyên tử của mảnh thứ nhất đối với quá trình tương tác yếu xảy ra tại tâm gắn kết là khơng đáng kể. Khi đó protein được sử dụng để chuẩn bị đầu vào cho các tính tốn MM/MD là phần protein PBP2a đã được cắt 300 axit amin.
Hình 3.2. Nếp gấp β3 (gồm các axit amin 594-603); cuộn Z (bao gồm các axit amin 436 đến 448)
Để định lượng ảnh hưởng của việc bỏ qua mảnh thứ nhất đến động học của tâm gắn kết nhằm rút ngắn thời gian tính, chúng tơi đã thực hiện những tính tốn mơ phỏng động lực phân tử (MD) trên phần mềm GROMACS với hệ phức axyl methicillin -PBP2ạ Cấu trúc tinh thể phức axyl của methicillin với PBP2a (ký hiệu trong PDB là 1MWU) được sử dụng làm cấu trúc ban đầụ Quy trình tính được trình bày chi tiết trong tài liệu của GROMACS. Thời gian ghi cấu hình tức thời của hệ là 1ns. Hình 3.4 minh họa về ảnh hưởng của hai mảnh khi đã cắt 300 axit amin ban đầu và khi chưa cắt của PBP2a đến động lực học gắn kết phối tử. RMSD (root mean square deviation) - Độ sai lệch bình phương trung bình, đại lượng này đánh giá khả năng linh động của phần tử cần theo dõị Hình 3.4 cho thấy độ sai lệch bình phương trung bình
của methicillin khi khớp với toàn bộ tọa độ các nguyên tử ở cấu hình ban đầu của PBP2a đầy đủ không khác đáng kể so với giá trị thu được khi khớp với các nguyên tử trong PBP2a* ở cấu hình ban đầu đã cắt bỏ mảnh thứ nhất.
Hình 3.3. Cấu hình của PBP2a (vùng m u đậm và nhạt), PBP2a* (m u đậm) và Ser 403 (các quả c u)
Điều này chứng tỏ cấu trúc protein đã cắt bỏ mảnh thứ nhất (ký hiệu PBP2a*) là đủ cho các nghiên cứu về động học của sự gắn kết phối tử tại tâm gắn kết.
Ngoài việc cắt bỏ phân mảnh thứ nhất, có 3 kiểu protein được dùng trong các tính tốn dưới đây: i) cấu trúc tinh thể apo (protein khơng phối tử) có ký hiệu 1VQQ trong Ngân hàng dữ liệu protein (PDB) ; ii) cấu trúc apo hydrat hóa trung bình tính được từ kết quả mơ phỏng động lực phân tử ở 298K có cấu trúc i) là cấu hình ban đầu và iii) cấu trúc protein trong các tinh thể phức axyl của methicillin và nitrocefin có ký hiệu PDB tương ứng là 1MWU và 1MWS. Cấu trúc tinh thể enzym PBP2a lấy từ PDB được bổ sung các axit amin còn thiếu bằng phần mềm Modeller. Các nguyên tử Hyđro được bổ sung và các tệp topo của protein nhận được từ mođun pdb2gmx của phần mềm GROMACS.
Cấu trúc của các phối tử methicillin (MC1) và nitrocefin (NC1) được tối ưu đầy đủ bằng phương pháp phiếm hàm mật độ với gần đúng B3LYP sử dụng bộ hàm cơ sở 6-31G* thực hiện trên phần mềm GAUSSIAN 09. Thông tin về topo phân tử nhận được bằng phần mềm trực tuyến PRODRG.