P hn mềm gắn kết AutoDock và động lực phân tử GROMACS
Phối tử MC1 NC
Phối tử MC1 NC1 Phức michaelis khe β3Z đóng michaelis khe β3Z mở axyl$ michaelis khe β3Z đóng michaelis khe β3Z mở axyl$
∆EMM -425,34 +/-18,68 -997,90 +/-18,17 -537,91 +/-9,98 -492,03 +/-16,69 -1560,11 +/-17,68 -838,87 +/-15,61 ∆ESASA -19,33 +/- 0,35 -17,32 +/- 0,37 -15,90 +/-0,28 -7,84 +/- 0,26 -16,10 +/- 0,34 -16,48 +/-0,32 ∆GPB 92,47 +/- 3,05 3,38 +/- 4,99 -597,53 +/- 5,03 37,86 +/- 3,29 12,70 +/- 7,35 -669,84 +/-5,52 ∆GSOL= pb+sasa -3,40 -686,32 ∆GTOT =sol+mm -352,20 +/-19,37 -1018,60 +/-19,35 - 1151,35 +/-11,0 -462,01 +/-16,46 -1563,52 +/-19,89 -1525,18 +/-17,47
Kd(mM) 16,9 [số liệu tham khảo] 0,19[số liệu tham khảo]
K2 s–1 0,0083 0,0037
* Giá trị trung bình của 50 cấu hình tức thời cách nhau 20ps mơ phỏng MD
từ 9ns đến 10 ns
$ Sử dụng gần đúng giả kim (alchemistry) rằng liên kết C-O giữa C của nhóm xeton trong vịng lactam và Oγ của Ser403 bị cắt đứt nhưng vẫn giữ nguyên vị trí của tất cả các ngun tử để tính tốn theo phần mềm APBS. Giá trị này được dùng để đánh giá phần góp khơng cộng hố trị (non-covalent) của tương tác trong phức axyl giữa phối tử và protein.
Bảng 4.3 trình bày các thành phần của năng lượng tự do gắn kết (kJ.mol- 1) tính tốn được của 6 hệ mơ phỏng bao gồm các phức axyl, phức michaelis khe β3Z đóng và phức michaelis khe β3Z mở của PBP2a* với nitrocefin và methicillin. Năng lượng tự do gắn kết của phức michaelis NC1-PBP2a* khe β3Z đóng và mở lần lượt là -462,01 kJ.mol-1 và -1563,52 kJ.mol-1. Sự khác biệt giữa năng lượng tự do gắn kết của phức michaelis khe đóng và mở của methicillin cũng rất lớn (-352,20 and -1018,60 kJ.mol-1). Thứ tự năng lượng
tự do gắn kết của các phức michaelis khe mở với NC1 và MC1 (MC1<NC1) phù hợp hoàn toàn với thứ tự của hằng số Kd xác định từ thực nghiệm (16,9/ 0,19 mM).
Về cơ chế kháng β-lactam của PBP2a
Một điều thú vị là tất cả các phức michaelis của methicillin và nitrocefin và phần khơng cộng hóa trị của phức axyl đều có phần góp pha khí ∆EMM
(từ -425,34 đến -1560,11 kJ.mol-1 tương ứng với phức MC1 khe đóng và phức NC1 khe mở) lớn hơn so với năng lượng liên kết đơn C-O chuẩn (-357,97 kJ.mol-1). Điều đó minh họa vai trị quan trọng của tương tác khơng cộng hóa trị trong hệ phức enzym-phối tử. Phần khơng cộng hóa trị của năng lượng tự do gắn kết của phức axyl xấp xỉ với năng lượng tự do của các phức khe mở. Năng lượng tự do gắn kết của phức michaelis khe mở thấp hơn nhiều so với phức khe đóng. Đáng kể nhất là ∆GPB
của phức axyl thấp hơn nhiều so với các giá trị tương ứng của cả hai phức michaelis khe đóng và khe mở trong khi đó, ∆EMM
của phức axyl nằm khoảng giữa các giá trị của phức michaelis khe đóng và khe mở. Bởi vì các giá trị năng lượng tự do gắn kết của phức axyl và phức michaelis khe mở gần xấp xỉ nhau nên có thể giả thiết rằng trong q trình axyl hóa các tương tác cặp ngun tử axit amin của PBP2a – phối tử bị yếu đi (năng lượng tự do pha khí ∆EMM
tăng lên) trong khi lớp vỏ hydrat hóa trở nên bền hơn (∆GPB giảm đi so với trong phức michaelis khe mở).
Ái lực đối với β-lactam của enzym PBP2a là cao, hoạt tính của β-lactam khơng chỉ phụ thuộc vào giai đoạn tạo axyl mà còn vào việc phối tử thâm nhập vào vùng hoạt động để tiếp cận tâm hoạt động Ser403 tạo nên một phức michaelis thích hợp cho axyl hóạ Điều đó phụ thuộc vào cấu trúc của khe β3Z và sự linh động của phối tử cũng như của các axit amin vùng hoạt động để đưa phối tử đi qua khe hẹp nàỵ Điểm mấu chốt ngăn cản sự tiếp cận này chính là khe β3Z. Nếu khe này đóng thì khả năng tiếp cận Ser403 là không thể
và việc lách qua khe hẹp này được quyết định bởi tính linh động của các phối tử và đi kèm là tính linh động của các axit amin trong vùng hoạt động. Kết quả này hồn tồn phù hợp với những tính tốn đã thảo luận ở trên về tính linh động của phối tử cũng như các axit amin.
Trên cơ sở các tính tốn mơ phỏng động lực phân tử 10ns của 6 hệ phức trong đó có 4 hệ phức michaelis của methicillin và nitrocefin với các cấu trúc khác nhau của PBP2a* bao gồm cấu trúc có khe β3Z mở và cấu trúc có khe β3Z đóng cùng với 2 hệ phức axyl sử dụng gần đúng giả kim thuật – cắt đứt liên kết C-O giữa C của nhóm xeton trong vịng lactam với Oγ của Ser403 trong khi vẫn giữ nguyên tọa độ của các nguyên tử, chúng tôi đã lựa chọn 50 số liệu tức thời ở 1ns mơ phỏng cuối cùng để tính năng lượng tự do gắn kết bằng thuật giải Poisson-Boltzmann trên phần mềm APBS. Qua việc tiến hành tính tốn động lực phân tử tới 10 ns và việc phân tích sự biến đổi cấu trúc và năng lượng của chất kháng sinh tạo phức với protein cho hệ apo và 4 hệ phức của methicillin và nitrocefin với PBP2a*. Chúng tôi nhận được kết quả là sự thay đổi cấu hình vùng tâm hoạt động của phức nitrocefin lớn hơn hẳn so với phức methicillin trong khi nitrocefin lại có khả năng ức chế MRSA lớn hơn hẳn so với methicillin nên sự sắp xếp lại xoắn α2 đầu N và nếp gấp β3 trong vùng hoạt động không phải là lý do duy nhất của việc kháng thuốc. Một lý do khác chính là tính linh động của phân tử chất thụ động cũng như của một số axit amin vùng hoạt động đã tăng cường khả năng ức chế và ngược lại, tính linh động của các phần tử này giảm đi sẽ làm cho tính kháng chất thụ động tăng lên. Đây là điểm mới có thể dùng để khảo sát đặc điểm của β-lactam trong tương tác yếu với PBP2ạ Phương pháp nghiên cứu này cho một cách tiếp cận có thể đánh giá trước được về khả năng ức chế, cơ chế tương tác, năng lượng, cấu trúc của các liên kết yếu giữa thuốc với enzymẹ Một việc
làm rất cần thiết cho việc thiết kết và tìm kiếm các thuốc mới có khả năng ức chế tốt hơn các thuốc đã biết về tương tác khơng cộng hóa trị.
Con đường mới cho việc thiết kế thuốc
Khả năng của PBP2a hoạt động như một transpeptidase duy nhất trong việc tổng hợp thành tế bào dưới sự chọn lựa β-lactam đã ngăn ngừa sự phát triển của việc kháng thuốc trong các PBP thông thường được tạo ra bởi SẠ PBP2a cung cấp một đích duy nhất cho việc phát triển của các chất ức chế đặc biệt chống lại MRSA, và sẽ thuận lợi hơn nữa bởi thông tin về cấu trúc tâm hoạt động, về phối tử, về enzym và các tính chất hóa lý quan trọng khác được trình bày ở đâỵ Chúng tơi cho rằng hiệu quả axyl hóa kém là bản chất của PBP2a, một khía cạnh quan trọng cho thiết kế chất ức chế sẽ là cải thiện ái lực liên kết bằng cách tăng số tương tác khơng cộng hóa trị giữa chất ức chế và tâm hoạt động. Trong việc thiết kế các chất ức chế β-lactam hiệu quả hơn, giảm giá trị Kd được kì vọng là góp cơng lớn để cải thiện tốc độ axyl hóa tổng (K2/Kd). Phù hợp với điều này, ái lực cao hơn của một vài cephalosporins cho PBP2a liên quan đến nhóm thế dài hơn của chúng, điều đó sẽ cung cấp một phần bù có cấu hình tốt hơn cho rãnh hẹp của tâm hoạt động và cho phép nhiều tương tác làm bền khơng cộng hóa trị hơn. Một cách thay thế, các hợp chất khơng phải β-lactam khơng liên kết cộng hóa trị mà liên kết chặt chẽ với tâm hoạt động khơng cần đến q trình axyl hóa cũng có thể là các chất ức chế hiệu quả. Giá trị IC50 tầm milimol cho PBP2a* có thể là dấu hiệu cho các chất ức chế tiềm năng. Các chất ức chế khơng liên kết cộng hóa trị sẽ khơng địi hỏi sự thay đổi cấu hình phải thuận lợi như trong PBP2a địi hỏi cho sự axyl hóa và cũng sẽ khơng bị ảnh hưởng bởi các β-lactammase70.