Vật liệu nghiên cứu ựược sử dụng trong luận án gồm: các chủng nấm men
Lipomyces; ựất; phân bón; cây trồng và sinh vật đất.
2.1.1. Các chủng nấm men Lipomyces
Các chủng nấm men Lipomyces sử dụng trong luận án ựược phân lập từ ựất gị đồi huyện Tam Nơng, tỉnh Phú Thọ và từ ựất thuộc Trạm đa dạng Sinh học (đDSH) - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, xã Ngọc Thanh, huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc:
Các chủng nấm men Lipomyces PT2.2, PT2.3, PT7.1, PT7.2, PT7.3, PT7.4 có trong bộ sưu tập của Phịng Hoạt chất sinh học từ vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, ựược phân lập từ đất gị đồi huyện Tam Nơng, tỉnh Phú Thọ vào mùa khơ năm 2003. Mẫu đất phân lập nấm menLipomycesựược lấy từ các tầng ựất của phẫu diện PT7 trên vị trắ ựồi bát úp với ựộ dốc khoảng 8 - 15ồ, toạ ựộ 21ồ10Ỗ08Ợ VđB và 105ồ08Ỗ19Ợ Kđđ. Lớp thảm thực vật trên phẫu diện PT7 chủ yếu là những cây ưa nắng, chịu hạn như bạch ựàn, cỏ tranh, sim, muạ đất phát triển trên ựá biến chất, mặt đất ở trạng thái bị xói mịn nhẹ. Theo phân loại đất thì đất phẫu diện PT7 là ựất xám bạc màu (ký hiệu X); theo phân loại của FAO - UNESCO thì đất thuộc loại Haplic Acrisols (ký hiệu ACh). Hai tầng trên của phẫu diện ựất, nơi lấy mẫu phân lập các chủng nấm menLipomyces, được mơ tả như sau:
+ Tầng A (0 -13cm): đất có màu xám sáng, xám đến xám đen, khơ đến ẩm, thành phần cơ giới thịt nhẹ, kiến trúc cục nhỏ, bóp tơi, bở rờị Phần trên mặt rửa trơi thành những dịng bụi cát trắng, ắt mùn, ắt rễ cây nhỏ, chặt, chặt dắ, chuyển lớp rõ về màu sắc.
+ Tầng B (13 - 35cm): Màu vàng xám, thành phần cơ giới thịt nhẹ ựến trung bình. Kiến trúc cục nhỏ, kém bền vững, bóp tơi, bở rời, có lẫn những hạt kết von có đường kắnh 2-5 cm, ựất chặt bao gồm các kết von bao quanh các mảnh phong hoá tồn lưu [22].
Các chủng nấm men Lipomyces VP1, VP2, VP3 và các nhóm VSV chắnh (VK, xạ khuẩn, nấm sợi, nấm men, nấm menLipomyces) ựược phân lập từ các mẫu
ựất thuộc trạm đDSH, Viện ST&TNSV, thuộc Viện KH&CN. địa hình ở đây chủ yếu là gị đồị Mẫu đất được lấy theo phương pháp lấy mẫu ựiểm ở tầng sâu 0 - 30 cm và 30 - 50cm vào tháng 10/ 2004 theo các vị trắ chân đồi, sườn đồi và đỉnh đồị độ dốc của ựồi khoảng 8 -15ồvới lớp thảm thực vật bao phủ chủ yếu là rừng keo tai tượng, dây leo, cây bụị
Tắnh chất vật lý, hố học cơ bản của ựất phẫu diện thể hiện ở các bảng sau::
1. địa ựiểm: Trạm đa dạng sinh học huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc 2. Vị trắ phẫu diện: Sườn đồi 3. Tọa ựộ: 21o13Ỗ41Ợ VđB,
105o25Ỗ38Ợ Kđđ, ựộ cao 77m 4. độ dốc: 8 -15Ứ
5. địa hình, địa mạo: gị đồi 6. Thực vật: Cây bụi, cỏ 7. Mẫu chất: Sa diệp thạch 8. Xói mịn: Xói mịn thấp 9. Tên đất: Feralic Acrisols
đặc điểm hình thái phẫu diện đất
Ớ 0 - 20cm: Xám sáng, thịt pha cát, khô, dưới ẩm hơn, chặt cứng, nhiều rễ cỏ, chuyển tầng rõ
Ớ 20 - 40cm: Nâu xỉn, thịt pha cát, ẩm, chặt, ẩm, khơng có rễ cây, có ắt vệt nâu vàng rỉ sắt, chuyển lớp từ từ
Ớ 40 - 60cm: Nâu hơi vàng, thịt pha sét và pha cát, ẩm, chặt, có ắt vệ nâu vàng rỉ sắt, chuyển lớp từ từ
Ớ 60 - 100cm: Vàng xỉn, thịt pha sét và pha cát, ẩm, có vệt vàng nâu rỉ sắt, có ắt vệt than, chuyển lớp từ từ
Ớ 100 - 140cm: Vàng xỉn, thịt pha sét và pha cát, ẩm, mềm, có nhiều vết vàng nâu
Những tắnh chất lý, hố học cơ bản của ựất phẫu diện thể hiện ở các bảng sau:
Bảng 2.1 Tắnh chất vật lý của đất phẫu diện VP
Thành phần cấp hạt, % độ sâu, cm Dung trọng, g/cm3 Tỷ trọng độ xốp, % độ ẩm, % 2,0- 0,2 mm 0,2- 0,02 mm 0,02- 0,002 mm <0,002 mm 0-20 1,28 2,59 51,7 12,2 28,6 43,1 20,7 7,6 20-40 1,42 2,65 42,9 17,1 30,0 50,3 1,8 17,9 40-60 1,59 2,67 40,4 17,6 30,1 45,0 1,9 23,0 60-100 1,62 2,58 36,0 25,6 29,2 39,0 2,8 29,0 100-140 1,68 2,60 35,8 27,9 30,2 41,3 4,7 23,8
Bảng 2.2 Các tắnh chất lý - hóa của đất phẫu diện VP
Tổng số, % Dễ tiêu, mg/100g độ chua, mgdl/100g ựất pH độ sâu, cm CHC N P2O5 K2O P2O5 K2O Trao ựổi Tiềm tàng H2O KCl 0-20 1,81 0,11 0,05 0,09 3,15 10,21 0,86 3,53 4,7 4,02 20-40 1,08 0,07 0,04 0,09 3,81 12,21 1,68 5,48 4,8 4,06 40-60 0,97 0,05 0,03 0,07 1,62 12,31 1,96 6,12 4,9 4,12 60-100 0,30 0,03 0,02 0,05 0,84 12,41 2,12 6,42 4,7 4,23 100-140 0,30 0,01 0,00 0,06 0,53 13,62 2,30 6,80 4,8 4,31
Bảng 2.3 Thành phần cation trao ựổi của ựất phẫu diện VP
Cation trao ựổi và CEC của ựất, mgdl/100g ựất độ sâu, cm
Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Tổng lượng cation
bazơ trao ựổi CEC
0-20 2,7 1,3 0,217 0,02 4,237 6,71
20-40 2,9 0,6 0,259 0,01 3,769 6,72
40-60 3,2 0,1 0,261 0,03 3,591 6,78
60-100 3,1 0,1 0,263 0,00 3,463 6,37
Theo kết quả phân tắch cho thấy, mẫu chất của phẫu diện VP là sa diệp thạch. đất có pHKCltừ 4,02 - 4,31 và pHH2Otừ 4,70 - 4,90. Hàm lượng chất hữu cơ nghèo, tầng đất khơng dày, thành phần cơ giới của ựất từ thịt pha cát ựến thịt pha sét và pha cát. Theo phân loại đất thì ựất phẫu diện VP là ựất xám feralit (ký hiệu Xf); theo phân loại ựất của FAO - UNESCO thì đất thuộc loại Ferralic Acrisols (ACf).
2.1.2. đất sử dụng trong các thắ nghiệm ựánh giá tác dụng của chếphẩm Lipomycin M phẩm Lipomycin M
đất sử dụng cho thắ nghiệm trong chậu được lấy từ đất tại Trạm đDSH thuộc huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc
Thắ nghiệm đồng ruộng được bố trắ và tiến hành ngay trên ựất thuộc trạm đDSH trên các lơ đất ựã trồng sẵn cây thuốc nam và ựồi trồng chè.
2.1.3. Phân bón dùng trong các cơng thức thắ nghiệm để đánh giá tácdụng của chế phẩm Lipomycin M dụng của chế phẩm Lipomycin M
Ớ Phân vi sinh ựa chức năng (gọi tắt là phân vi sinh) do viện Công nghệ sinh học sản xuất bao gồm các chủng VK cố ựịnh ựạm và kắch thắch sinh trưởng (Enterobacter aerogenes, Azotobacter chrococcum), VK phân giải lân (Bulkholderoa sp), nấm sợi phân giải lân (Aspergillus anamori), VK ựối kháng bệnh cây (Baccillus subtilis).
Ớ Phân khoáng tổng hợp NPK (mua trên thị trường)
Ớ Chế phẩm vi sinh giữ ẩm ựất Lipomycin M do Phòng Hoạt chất Sinh học từ Vi sinh vật (HCSH từ VSV), Viện CNSH sản xuất. Chế phẩm gồm 2 thành phần chắnh là chủng nấm menLipomyces PT7.1 và cơ chất tinh bột sắn.
2.1.4. Các loại cây trồng dùng trong thắ nghiệm
Ớ Cây keo lá tràm (Acacia auriculiformis) và cây bạch ựàn (Eucalyptus) ựược sử dụng cho thắ nghiệm trong chậu ựể ựánh giá khả năng giữ ẩm của chế phẩm Lipomycin M. Hai loại cây này ựược mua ở vườn ươm cây lâm nghiệp, Cầu Diễn, Hà Nộị Cây khoẻ mạnh, khơng bệnh, cao trung bình 16 - 17 cm.
Ớ Các cây thuốc nam trong thắ nghiệm đồng ruộng ựược trồng sẵn ở trạm đDSH thuộc huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc bao gồm: cây Ba chạc -Euodia
lepta Merr., thuộc họ Cam - Rutaceae; cây Thanh táo - Justicia gendrarussa
L.f., thuộc họ Ơ rơ - Acanthaceae; cây Mỏ quạ - Mactura cochinchinensis
(Lour.) Corner, thuộc họ Dâu tằm - Moraceae và cây Chè xanh - Camellia sinensis (L.) Ọ Ktze, thuộc họ Chè - Theaceae. Mật ựộ cây thuốc nam
khoảng 2 cây/ m2. Mật ựộ cây chè là 1x0,20m (trong 1 hàng chè mỗi cây cách nhau 20 cm), tắnh chung cho cả ựồi chè thì mật ựộ khoảng 2 - 3 cây/ m2. Chế phẩm Lipomycin M ựược bón trực tiếp vào đất dưới những gốc cây này nhằm ựánh giá tác ựộng của chế phẩm đến các tắnh chất lý, hóa học và sinh học của ựất.
2.1.5. Sinh vật ựất
Ớ Giun đất thuộc chiPheretima ựược lấy từ ựất của trạm đDSH tại huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc và ựược sử dụng trong các thắ nghiệm trong chậu để đánh giá tắnh an tồn sinh học của chế phẩm Lipomycin M ựối với hệ ựộng vật đất.
Ớ Giun đất và một số nhóm mesofauna khác ựược xác ựịnh số lượng ngay trên đồng ruộng (thắ nghiệm trồng cây thuốc nam và ựồi cây chè) và ựịnh dạng đến lồi trong phịng thắ nghiệm nhằm đánh giá tắnh an tồn sinh học của chế phẩm Lipomycin M lên khu hệ sinh vật ựất trong ựiều kiện tự nhiên.
Ớ Các nhóm VSV chắnh của đất như nấm men, nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm men Lipomyces ựược xác định ở thắ nghiệm trong chậu và ngồi đồng ruộng nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của chế phẩm Lipomycin M ựến tập đồn VSV đất.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
* Thắ nghiHm trong ch2u
Thắ nghiệm trong chậu được tiến hành ựể nghiên cứu những nội dung sau: Ớ Ảnh hưởng của liều lượng chế phẩm Lipomycin M được bón đến khả năng
giữ ẩm đất.
Ớ Xác ựịnh khoảng thời gian thắch hợp bón lại chế phẩm thông qua sự biến ựộng số lượng nấm men Lipomyces có trong đất sau khi bón chế phẩm Lipomycin M.
Ớ Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Lipomycin M ựến khả năng giữ ẩm cho đất thơng qua động thái độ ẩm đất trồng cây keo lá tràm và cây bạch ựàn Ớ đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm Lipomycin M đến tắnh chất sinh học ựất
thông qua sinh trưởng của giun đất và các nhóm vi sinh vật chắnh trong ựất Ớ Khả năng giữ ẩm cho ựất của chế phẩm Lipomycin M thông qua sự biến
động độ ẩm đất có trồng cây keo lá tràm và bạch ựàn.
đất sử dụng cho thắ nghiệm trong chậu được lấy từ Trạm đDSH thuộc huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc. đất lấy ở tầng mặt 0 - 20cm, lấy hỗn hợp trên các lơ đất trồng cây thuốc nam, sau đó làm tơi, loại bỏ xác thực vật, ựá và các vật cứng khác, trộn ựềụ
Cơng thức và cách bố trắ thắ nghiệm:
Thắ nghiệm 1.Nghiên cứu liều lượng bón chế phẩm Lipomycin M cho đất
Thắ nghiệm được tiến hành nhằm xác ựịnh liều lượng bón chế phẩm Lipomycin M thắch hợp cho đất thơng qua sự biến ựộng ựộ ẩm ựất theo thời gian ở các chậu thắ nghiệm khơng trồng câỵ Từ đó đưa ra liều lượng bón thắch hợp cho các thắ nghiệm tiếp theọ Thắ nghiệm được bố trắ trên 4 công thức với 3 liều lượng bón chế phẩm khác nhau, mỗi cơng thức được nhắc lại 3 lần. Tổng số chậu dùng trong thắ nghiệm 1 là 12 chậu, được bố trắ như sau;
Ớ đối chứng (đC): Khơng bón chế phẩm Lipomycin M.
Ớ Cơng thức 1 (CT1): Bón 5g chế phẩm Lipomycin M cho 1 chậu thắ nghiệm chứa 10kg ựất.
Ớ Cơng thức 2 (CT2): Bón 10g chế phẩm Lipomycin M cho 1 chậu thắ nghiệm chứa 10kg ựất.
Ớ Cơng thức 3 (CT3): Bón 15g chế phẩm Lipomycin M cho 1 chậu thắ nghiệm chứa 10kg ựất.
Cân 10 kg ựất ựã ựược làm tơi ở trên, trộn ựều, loại bỏ các xác hữu cơ thơ cho vào chậu lớn (đường kắnh 25cm, cao 40cm). đất trong mỗi chậu được nén chặt vừa phải và trộn vào mỗi chậu số lượng gam chế phẩm Lipomycin M tương ứng ở lớp ựất 0 - 20cm trong chậụ Các chậu thắ nghiệm được đặt trong sân nhà Pilốt Vi sinh Ạ24 của Viện Công nghệ Sinh học, ựể bốc hơi tự nhiên, không tưới nước.
lấy 2 tuần/ lần. Vị trắ lấy mẫu trong khoảng 0 - 20cm so với bề mặt ựất trong chậu (vùng có trộn chế phẩm).
Dựa trên các liều lượng nghiên cứu có thể ựưa ra ựược liều lượng thắch hợp và áp dụng liều lượng này trong tất cả các thắ nghiệm tiếp theọ
Thắ nghiệm 2. Nghiên cứu sự biến ựộng số lượng nấm men Lipomyces trong ựất sau khi bón chế phẩm Lipomycin M.
Thắ nghiệm được tiến hành nhằm nhằm xác ựịnh khoảng thời gian chế phẩm Lipomycin M phát huy hiệu lực tốt nhất thơng qua việc xác định sự biến ựộng số lượng nấm men Lipomyces trong ựất sau khi bón chế phẩm Lipomycin M. Thắ nghiệm này tiến hành dựa trên cơ sở liều lượng bón chế phẩm Lipomycin M tối ưu cho ựất (kết quả nghiên cứu trong thắ nghiệm 1) là 10g/ chậu (10kg đất). Thắ nghiệm được nhắc lại ba lần với hai công thức (gồm 6 chậu thắ nghiệm):
Ớ đối chứng (đC): Bón cơ chất bột sắn khơng chứa nấm men Lipomyces 10g/ chậụ
Ớ Thắ nghiệm (TN): Bón 10g chế phẩm Lipomycin M/ chậụ
Cân 10 kg ựất ựã ựược làm tơi ở phần trên, trộn ựều, loại bỏ các xác hữu cơ thơ cho vào chậu lớn (đường kắnh 25cm, cao 40cm). Chế phẩm Lipomycin M được trộn ựều ở tầng ựất mặt của chậu (0 - 20cm). Thời gian lấy mẫu ựể xác ựịnh số lượng nấm menLipomycestrong ựất ựược tiến hành 15 ngày một lần.
Thắ nghiệm 3.Nghiên cứu khả năng giữ ẩm cho ựất của chế phẩm Lipomycin M
Thắ nghiệm tiến hành trong chậu có trồng cây bạch đàn và keo lá tràm nhằm xác ựịnh khả năng giữ ẩm cho ựất của chế phẩm Lipomycin M thơng qua động thái độ ẩm của ựất với sự bốc hơi tự nhiên từ ựất và thốt hơi sinh học từ cây trồng. Thắ nghiệm ựược nhắc lại ba lần với hai cơng thức (đối với mỗi loại cây có 6 chậu thắ nghiệm):
Ớ đối chứng (đC): Bón cơ chất tinh bột sắn (khơng có nấm men Lipomyces)
10g/ chậụ
Ớ Thắ nghiệm (TN): Bón chế phẩm Lipomycin M 10g/ chậụ
Cân 10 kg ựất ựã ựược làm tơi, trộn ựều, loại bỏ các xác hữu cơ thơ cho vào chậu lớn (đường kắnh 25cm, cao 40cm), làm chặt đất trong chậu vừa phải (d ≈1,1 g/ cm3), sau ựó trồng bạch ựàn và keo lá tràm. Trong mỗi chậu trồng 1 cây bạch ựàn
hoặc keo lá tràm. Các cây giống có độ cao trung bình bằng nhau (khoảng 16 - 17cm), cây khoẻ, không bệnh. Sau khi cây bén rễ mới tiến hành bón cơ chất tinh bột sắn cho cơng thức đối chứng và chế phẩm Lipomycin M cho cơng thức thắ nghiệm vào quanh vùng rễ câỵ Các chậu ựược ựặt trong sân nhà Pilốt Vi sinh Ạ24 của Viện Công nghệ Sinh học và khơng được tưới nước trong suốt thời gian thắ nghiệm. Thời gian thắ nghiệm kéo dài ựến 85 ngày ựối với cây keo lá tràm và 60 ngày ựối với cây bạch ựàn. Mẫu ựất dùng ựể xác ựịnh ựộ ẩm ựược lấy 2 tuần/ lần. Vị trắ lấy mẫu là ở quanh vùng rễ cây, ựộ sâu khoảng 0 - 20cm.
Thắ nghiệm 4.Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Lipomycin M ựến VSV ựất
Thắ nghiệm ựược tiến hành nhằm đánh giá tắnh an toàn sinh học của chế phẩm Lipomycin M ựối với các nhóm vi sinh vật chắnh trong đất. Thắ nghiệm ựược tiến hành trên hai công thức, mỗi công thức ựược nhắc lại 3 lần (gồm 6 chậu thắ nghiệm):
Ớ đối chứng (đC): Bón cơ chất bột sắn khơng chứa nấm men Lipomyces 10g/ chậu (10kg đất).
Ớ Thắ nghiệm (TN): Bón chế phẩm Lipomycin M 10g/ chậu (10kg ựất).
Cân 10 kg ựất ựã ựược làm tơi, trộn ựều, loại bỏ các xác hữu cơ thô cho vào chậu lớn (đường kắnh 25cm, cao 40cm), nén chặt vừa phảị Trộn chế phẩm Lipomycin M ở tầng ựất mặt (0-20cm) của chậu thắ nghiệm. Các chậu ựược ựặt trong nhà có mái che (nhà Pilốt Vi sinh Ạ24 của Viện Công nghệ Sinh học) và khơng được tưới nước trong suốt thời gian tiến hành thắ nghiệm. Lấy mẫu phân tắch các nhóm vi sinh vật chắnh của ựất ở ngày ựầu tiên, sau 3, 7, 11, 15 và 19 ngàỵ
Thắ nghiệm 5. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chế phẩm Lipomycin M ựến hệ ựộng vật đất
Thắ nghiệm được tiến hành nhằm nghiên cứu tắnh an tồn sinh học của chế phẩm Lipomycin M với hệ động vật đất thơng qua sự sinh trưởng của giun đất, thắ nghiệm được nhắc lại ba lần với ba công thức (9 chậu):
Ớ đối chứng (đC): Bón cơ chất tinh bột sắn 5g/ chậụ
Ớ Cơng thức 1 (CT1): Bón chế phẩm Lipomycin M 5g/ chậụ Ớ Cơng thức 2 (CT2): Bón chế phẩm Lipomycin M 10g/ chậụ
Cân 10kg ựất, thêm ắt lá mục cho vào mỗi chậu lớn (đường kắnh 25cm, cao 40cm), nén chặt vừa phải (ựộ chặt ựất gần bằng ựộ chặt thực tế ngồi đồng ruộng). Số chậu ựất tương ứng là 9 chậu (3 chậu đC, 3 chậu CT1, 3 chậu CT2), cho vào mỗi chậu 30 con giun ựất chi Pheretima. Bón cơ chất tinh bột sắn và chế phẩm
Lipomycin M vào các chậu tương ứng với các cơng thức thắ nghiệm bằng cách trộn ựều vào ựất trong chậụ Cách 2 ngày lại ựếm số lượng giun trong mỗi chậụ Thắ