2.2.1 Quy trình chế tạo giá thể chitosan/tinh bột/HA
Trong nghiên cứu này giá thể chitosan/tinh bột được chế tạo theo phương pháp đông tụ - sấy thăng hoa với quy trình chung được trình bày theo sơ đồ hình 2.4.
Hình 2. 4 Quy trình chế tạo giá thể chitosan/tinh bột/hydroxyapatite
Bột chitosan có khối lượng (tỷ lệ) theo bảng 2.1, được cho vào dung dịch acid acetic và khuấy trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 40-50 oC trong vòng 3 giờ, tạo dung dịch chitosan hồ tan hồn tồn. Sau đó, tinh bột biến tính có khối lượng (tỷ lệ) theo bảng 2.1 được trộn vào dung dịch và khuấy đều trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 90-100oC đến khi tất cả tinh bột chuyển sang dạng hồ tinh bột, tiếp tục khuấy hỗn hợp thêm 3 giờ hoặc 7 giờ dựa vào hai khoảng thời gian khảo sát (do các dung dịch tạo gel có độ nhớt khá cao vì
thể chỉ có thể khuấy ở tốc độ thấp). Gel được bơm vào xylanh và được bơm dung dịch chứa NaOH 0,25M và Na2SO4 0,375M hoặc trong dung dịch Ethanol 2M và NaOH 0,7M và được ngâm 8 giờ để tạo dạng viên đông tụ và tạo ổn định cho các viên kết tủa. Sau đó, các kết tủa chitosan-tinh bột sẽ được rửa với nước cất nhiều lần đến khi đạt được pH trung tính và loại bỏ hồn toàn lượng muối dư thừa. Các mẫu sau khi rửa sạch sẽ được đông lạnh ở nhiệt độ -40oC trước khi được sấy thăng hoa và thu thành phẩm cuối cùng. Các mẫu được bảo quản trong bình hút ẩm để tránh hư hại.
Với giá thể có hydroxyapatite, HA sẽ được siêu âm với 30ml dung dịch acid acetic 1% (v/v) trong vịng 30 phút, sau đó bột chitosan có khối lượng (tỷ lệ) theo bảng 2.1 sẽ được cho vào dung dịch acid acetic đã được phân tán HA và khuấy trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 40-50oC trong vòng 3 giờ, tiếp theo giá thể sẽ được tiếp tục chế tạo theo quy trình giá thể khơng có HA.
2.2.2 Các khảo sát ảnh hưởng đến tính chất cơ lý của giá thể
2.2.2.1 Khảo sát tỷ lệ khối lượng thành phần chitosan/tinh bột
Bảng 2. 1 Bảng tỷ lệ khối lượng chitosan/tinh bột trong 30ml dung dịch và ký hiệu Chitosan (g) Tinh bột (g) Tổng khối lượng (g) Tỷ lệ CS/TB 0,90 0,600 1,5 6/4 0,825 0,675 1,5 5,5/4,5 0,75 0,750 1,5 5/5 0,675 0,825 1,5 4,5/5,5 0,60 0,900 1,5 4/6
Tỷ lệ tinh bột và chitosan được thay đổi theo bảng 2.1 và được khảo sát với dung dịch đông tụ là NaOH-Na2SO4 và NaOH-Ethanol với thời gian khuấy 6 giờ và 10 giờ để xác định được tỷ lệ và phù hợp dựa trên cơ tính, độ phân huỷ, độ trương và độ rỗng.
2.2.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của dung dịch đơng tụ đến tính chất cơ lý của giá thể
Tỷ lệ tinh bột và chitosan thay đổi theo bảng 2.1 với tổng thời gian khuấy 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp chitosan/tinh bột được nhỏ từng giọt to vào 2 dung dịch tạo đông tụ khác nhau
gồm dung dich NaOH-Na2SO4 và dung dịch NaOH- Ethanol nhằm khảo sát để tạo kết tủa. Các viên kết tủa được lưu trong dung dịch này trong vòng 8 giờ. Mục tiêu của khảo sát này là nhằm lựa chọn được dung dịch để chế tạo giá thể kết tủa tốt về cơ tính, độ trương, độ rỗng, độ phân huỷ của giá thể.
Hình 2. 5 Mẫu giá thể được ngâm trong dung dịch đông tụ
2.2.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian khuấy đến tính chất cơ lý của giá thể
Tỷ lệ tinh bột và chitosan thay đổi theo bảng 2.1 được tiến hành khảo sát tổng thời gian khuấy trong vòng 6 giờ và 10 giờ, mẫu được ngâm trong dung dịch NaOH-Na2SO4 (theo kết quả khảo sát của mục 2.2.2.2) để xác định sự ảnh hưởng của thời gian khuấy đối với từng tỷ lệ và chọn ra thời gian khuấy tối ưu.
2.2.2.4 Khảo sát hàm lượng Hydroxyapatite đến tính chất cơ lý của giá thể
Qua kết quả khảo sát đánh giá mục 2.2.2.2 và 2.2.2.3 ta chọn giá thể chitosan/tinh bột có tỷ lệ 4,5/5,5 là vì giá thể này có cơ tính phù hợp cho việc thêm HA. Khi thêm HA HA cơ tính của giá thể sẽ tăng lên, các tỷ lệ giá thể chitosan/tinh bột có cơ tính cao khi thêm HA sẽ làm cho giá thể có cơ tính q cao gây ra hiện tượng giá thể bị giịn, mặt khác các giá thể có cơ tính cao sẽ có độ đặc cao ở trạng thái giá thể ướt, điều này gây ra khó khăn trong quá trình khuấy để chế tạo giá thể
Qua quan điểm trên tỷ lệ chitosan/tinh bột là 4,5-5,5 để khảo sát hàm lượng HA từ 0-10% ảnh hưởng đến tính chất cơ lý của giá thể qua đó chọn ra tỷ lệ HA tối ưu.
Bảng 2. 2 Hàm lượng Hydroxyapatite theo tổng khối lượng chitosan và tinh bột Hàm lượng HA (%) 0 2,5 5 7,5 10 Khối lượng HA (g) 0 0,0375 0,075 0,1125 0,15
2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu
2.2.3.1 Phương pháp đo cơ tính của của giá thể
Độ bền cơ của giá thể được tính tốn thơng qua modul đàn hồi Young, được tính tốn thơng qua đường cong ứng suất và biến dạng được thực hiện bằng máy TexturePro CT V1.9 Build 35, sử dụng đầu đặt lực có đường kính đầu đo 6mm, tốc độ gia lực 0,02 mm/s đến 50% độ biến đang. Mẫu dùng để đo cơ tính là mẫu ướt chưa qua quá trình sấy thăng hoa. Ứng suất nén σ được tính theo cơng thức sau:
𝜎 =𝐹 𝐴
Trong đó:
• 𝜎: Ứng suất nén (N/mm2) • F: Lực nén (N)
• A: Tiết diện của đầu đo tiếp xúc trực tiếp lên mẫu đo. Và được xác định theo cơng thức:
A(mm2) = 𝐷
2
4 × 𝜋=R2× 𝜋
Trong đó: D: Đường kính đầu đo (D=6mm) Biến dạng 𝜀 được tính theo cơng thức:
𝜀 = ∆𝐿 𝐿
Trong đó:
• 𝜀: Độ biến dạng (%)
• 𝐿: Độ dày mẫu ban đầu
2.2.3.2 Phương pháp đo độ rỗng
Độ rỗng của giá thể chitosan-tinh bột được xác định bằng phương pháp thay thế chất lỏng [68].
Mẫu có kích thước 10mmx10mmx2mm có khối lượng m1(g), bình chứa đầy hexan có khối lượng m2 (g). Giá thể được nhúng vào bình chứa đầy hexan. Sau khi loại bỏ lượng hexan dư, khối lượng cả bình, dung dịch hexan và mẫu cân có giá trị là m3 (g). Mẫu được ngâm trong vịng 5 phút. Sau đó, mẫu được lấy ra và cân lại khối lượng bình + hexan có giá trị là m4 (g). Độ rỗng (P) của giá thể được tính theo cơng thức:
𝑃% = (m3 − 𝑚4 − 𝑚1)/(𝑚2 − 𝑚4)
Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
• m2: Khối lượng bình chứa đầy hexan (g) • m3: Khối lượng cả bình, hexan và mẫu (g)
• m4: Khối lượng bình và hexan sau khi lấy mẫu ra (g)
2.2.3.3 Phương pháp đo độ trương
Độ trương (S) của giá thể được xác định theo phương pháp xác định khối lượng thay đổi [69]. Mẫu khơ ban đầu có khối lượng m1 (g) được ngâm trong nước cất ở 37oC trong vịng 24 giờ và 48 giờ. Sau đó, mẫu được vớt ra thấm hết nước dư thừa rồi cân khối lượng có giá trị m2(g). Độ trương nở của giá thể được tính theo cơng thức sau:
S(%)= 𝑚2−𝑚1 𝑚1 x100 Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu khơ ban đầu (g) • m2: Khối lượng mẫu ướt sau khi ngâm (g)
2.2.3.4 Phương pháp xác định độ phân huỷ
Độ phân huỷ (D) của giá thể sau khi sấy thăng hoa được xác định theo phương pháp xác định sự thay đổi khối lượng mẫu theo thời gian ngâm trong dung dịch [69]. Mẫu có kích thước 10mmx10mmx2mm được cân xác định khối lượng m1 (g). Mẫu được ngâm trong 15ml dung dịch muối đệm photphat (PBS) ở 37oC trong 7 ngày và 14 ngày. Dung dịch đệm PBS được thay mới ba ngày một lần. Sau đó, mẫu được lấy ra rửa sạch vài lần bằng nước cất và được sấy thăng hoa, cân và xác định khối lượng m2. Độ phân huỷ được xác định theo công thức sau:
D (%) =𝑚2−𝑚1 𝑚1 x100 Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu khơ ban đầu (g)
• m2: Khối lượng mẫu khô sau khi ngâm phân rã và đã được sấy thăng hoa (g)
2.2.3.5 Phương pháp xác định lượng Ca2+ được giải phóng
Hình 2. 6 Thiết bị sắc ký ion AS-DV
Xác định hàm lượng Ca2+ giải phóng ra khỏi giá thể nhằm dự đốn khả năng tạo xương mới của giá thể.
Mẫu dạng viên hạt đã sấy thăng hoa có đường kính 5mm sẽ được ngâm trong dung dịch muối đệm photphat (PBS) ở 37oC trong 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Phần nước sau khi
ngâm mẫu giá thể chitosan/tinh bột/hydroxyapatite sẽ được lọc bằng đầu lọc có kích thước lỗ bằng 0,22µm và cho vào virals để tiến hành đo hàm lượng Ca2+ giải phóng ra khỏi giá thể. Phương pháp đo thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký ion IC là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động trên thiết bị sắc ký ion AS-DV trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM.
2.2.3.6 Kính hiển vi điện tử SEM và phổ tán xạ năng lượng EDS
Hình 2. 7 Thiết bị đo SEM TM4000Plus
Kính hiển vi điện tử SEM được sử dụng để xác định hình thái, cấu trúc của Hydroxyapatite tổng hợp từ xương gà và hình thái cấu trúc (kích thước lỗ rỗng, cấu tạo sự phân bố của lỗ rỗng) của giá thể chitosan-tinh bột, sự phân bố của HA trên bề mặt và bên trong giá thể.
Mẫu dùng để phân tích SEM kích thước 10 mm x 10 mm, được phủ bằng hợp kim Pt/Pd trước khi quét bằng TM4000PLUS của Hitachi tại trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM sử dụng tia BSE. Ngoài ra trong TM4000PLUS được kết hợp EDS (Energy Dispersive X-Ray Spectrometer) – Bruker dùng để xác định sự có mặt và phân bố của HA trên bề mặt và bên trong giá thể.
2.2.3.7 Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại (FTIR)
Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) là phương pháp được ứng dụng để phân tích cấu trúc hố học của vật liệu, bằng cách kiểm tra các liên kết hoá học và thành phần dựa vào các peak đặc trưng của nhóm chức.
Mẫu bột HA từ xương gà và mẫu giá thể có tỉ lệ 4,5/5,5 có hàm lượng HA theo bảng 2.2 sau khi được sấy thăng hoa sẽ được được chuẩn bị với kích thước 0,5x0,5x0,5 (cm) sẽ được đặt vào buồng chứa mẫu trên thiết bị Jabco FT IR 4700 (Nhật) tại trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM có vùng phổ có vùng số sóng từ 4000 – 400 cm-1 giúp xác định các nhóm chức đặc trưng của mẫu HA từ xương gà và các giá thể có HA đã được sấy thăng hoa. Mẫu trắng là khơng khí được đo cùng điều kiện như trên. Phổ thu được sau khi đã trừ phổ của mẫu trắng, CO2 của khơng khí và hơi ẩm.
Hình 2. 8 Ảnh thiết bị đo FTIR JABCO FTIR 4700
2.2.3.8 Phương pháp phân tích phổ nhiễu xạ tia X
Phương pháp này được sử dụng để khảo sát cấu trúc pha của tinh bột, chitosan, HA và giá thể composite bằng thiết bị nhiễu xạ tia X (XRD phân tích cấu trúc) loại Empyrean hãng Malvern Panalytical (Vương Quốc Anh) với bức xạ Kα1= 1.5406 của Cu là λα = 1.5418 Å, góc quét 2𝜃 = 0 – 80oC trường Đại học Tài chính – Marketing.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả giá thể composite chitosan - tinh bột
3.1.1 Hình ảnh cảm quan của giá thể
A: giá thể chitosan/tinh bột tỷ lệ 4,5/5,5 trước khi sấy thăng hoa
B: giá thể chitosan/tinh bột tỷ lệ 4,5/5,5 sau khi sấy thăng hoa
Hình 3. 1 Hình ảnh giá thể chitosan/tinh bột trước và sau khi sấy thăng hoa Giá thể chitosan-tinh bột có màu vàng nhạt và một số điểm trắng trên bề mặt có thể do Giá thể chitosan-tinh bột có màu vàng nhạt và một số điểm trắng trên bề mặt có thể do lượng tinh bột chưa phản ứng hết hồn tồn với chitosan được lơi cuốn theo nước ra bên ngồi trong q trình sấy thăng hoa, giá thể khá cứng và giịn, có mật độ độ rỗng lớn và dễ hấp thụ nước. Giá thể trước khi sấy thăng hoa có kích thước lớn hơn so với giá thể sau sấy, mẫu có độ đàn hồi kém.
A: NaOH-EtOH B: NaOH-Na2SO4
Đánh giá cảm quan 2 giá thể được sử dụng 2 dung dịch đông tụ khác nhau cho thấy cả 2 giá thể đều có cấu trúc rỗng và độ rỗng giá thể rất lớn. Trong cấu trúc rỗng, vẫn có xuất hiện sự liên thông giữa các lỗ. Về mặt khác nhau, giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa Ethanol có màu vàng nhạt, ít xuất hiện đốm trắng của tinh bột trên bề mặt và mềm hơn, cơ tính thấp hơn giá thể đơng tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42-.
A: mặt cắt của giá thể B: Bề mặt của giá thể
Hình 3. 3 Hình ảnh phân tích SEM của giá thể chitosan/tinh bột: A: mặt cắt của giá thể; B: bề mặt của giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion sulfate
Kết quả phân tích SEM cho thấy giá thể được tạo ra có được mật độ rỗng ở trên bề mặt lẫn bên trong của giá thể.
3.1.2 Ảnh hưởng của dung dịch đơng tụ đến tính chất cơ lý của giá thể
Các tính chất vật lý của giá thể được thiết kế mô phỏng một cách lý tưởng các tính năng của chất nền ngoại bào tự nhiên để điều chỉnh chức năng tế bào. Do đó, việc kiểm sốt các đặc tính vật lý của giá thể như modulus đàn hồi và độ rỗng là những bước đầu tiên cho quá trình ứng dụng của giá thể trong các nghiên cứu sâu hơn.
3.1.2.1 Cơ tính
Dung dịch đơng tụ được sử dụng để ngâm giá thể trước khi sấy ảnh hưởng đến tính chất cơ của giá thể được thể hiện ở hình 3.4. Nhìn chung giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42- có Young modulus cao hơn so với giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa EtOH. Tuy nhiên có một ngoại lệ nằm ở tỷ lệ 6-4, giá thể được ngâm dung dịch NaOH-EtOH có modulus 125,3 KPa cao hơn giá thể được ngâm trong NaOH-Na2SO4
105,3 KPa. Giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42- có tỷ lệ 5/5 có cơ tính cao nhất với modulus đàn hồi đạt giá trị 171,1 KPa. Giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa EtOH có tỷ lệ 4,5/5,5 có cơ tính thấp nhất với 60,7 KPa. Theo nghiên cứu của East and Qin [70], những sợi chitosan được tạo ra từ phương pháp đông tụ-thăng hoa sử dụng dung dịch đông tụ có NaOH-Na2SO4 có được modulus tốt nhất, East and Qin cũng giải thích rằng khi sợi chitosan được ngâm trong dung dịch NaOH-Na2SO4 có sự gia tăng lực liên kết tăng mức độ kết tinh so với chitosan đông tụ trong các dung dịch khác.
Hình 3. 4 Cơ tính của giá thể theo các tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau trong các dung dịch đông tụ
3.1.2.2 Độ rỗng
Cấu trúc lỗ của chất nền ngoại bào (ví dụ, độ rỗng, khả năng liên kết giữa các lỗ và kích thước lỗ) ảnh hưởng đáng kể đến mức độ khuếch tán chất dinh dưỡng và oxy đối với sự tồn tại của tế bào cũng như loại bỏ chất thải trao đổi chất. Các nghiên cứu cho thấy các giá thể có độ rỗng khoảng 88% giúp cho sự phát triển mô xương tốt hơn [71].
Trong phương pháp đông tụ - sấy thăng hoa lỗ rỗng phụ thuộc vào tỷ lệ rắn/lỏng, và giai đoạn “hy sinh” của tinh bột tức là lượng tinh bột chưa phản ứng sẽ theo hơi nước trong quá trình sấy tạo thêm lỗ rỗng cho giá thể. Độ rỗng của giá thể được thể hiện ở hình 3.5.
ethanol đều có độ rỗng cao, từ 85,5%-89,9%. Đây là độ rỗng phù hợp trong ứng dụng thay thế mơ xương [71]. Khơng có sự chênh lệch độ rỗng nhiều giữa giá thể tạo từ 2 dung dịch khác nhau, độ chênh lệch về độ rỗng không đáng kể chỉ từ 2-3%. Tuy nhiên độ rỗng quá cao sẽ dẫn đến cơ tính của giá thể sẽ giảm, điều này được thể hiện ở giá thể