Kí hiệu mẫu:
- Cao tổng: cao tổng
- HR.EA: cao chiết phân đoạn ethyl acetat - HR.Bu: cao chiết phân đoạn n-butanol - HR Hex: cao chiết phân đoạn n-hexan - HR. H2O: cao chiết phân đoạn nước
- HR1: chất sạch Acid ursolic phân lập từ phân đoạn ethyl acetat - HR2: chất sạch Corchoionol C phân lập từ phân đoạn ethyl acetat - HR3: chất sạch Acid betulinic phân lập từ phân đoạn ethyl acetat - HB3: chất sạch Mearnsitrin phân lập từ phân đoạn n-butanol
Dược liệu
- Chiết với ethanol 96%, 3 lần x 30 phút/ lần - Thu hồi dung mơi
Cao tồn phần
- Phân tán trong nước
- Chiết với n-hexan ( 1 lít x 3 lần)
- Thu hồi dung mơi
Phân đoạn nước
- Thu hồi dung môi
Phân đoạn nước
- Chiết với n-butanol (1 lít x 3 lần)
Phân đoạn n-butanol Phân đoạn nước
Phân đoạn
n-hexan
Phân đoạn ethyl acetat
- Thu hồi dung môi
2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO trên đại thực bào RAW 264.7 của dịch chiết phân đoạn và các chất tinh khiết phân lập được 264.7 của dịch chiết phân đoạn và các chất tinh khiết phân lập được
Nhiều mơ hình sàng lọc hợp chất kháng viêm đã và đang được các nhà khoa học sử dụng. Trong đó các mơ hình in vitro được thực hiện trên các tế bào ni cấy có ưu điểm thuận tiện và hiệu quả trong việc sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng viêm. Trong nghiên cứu về hợp chất kháng viêm, nhiều nhà nghiên cứu sử dụng đại thực bào như một mơ hình thử nghiệm. Có nhiều loại đại thực bào được sử dụng như RAW 264.7, J774, WEHI-3, P388D1. Trong đó mơ hình tế bào RAW 264.7 được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu sàng lọc các hợp chất tự nhiên.
Phương pháp được thực hiện theo phương pháp của Cheenpracha và cộng sự [42]
❖ Nguyên tắc
LPS là nội độc tố vi khuẩn, tác nhân gây viêm, kích thích tế bào đại thực bào RAW 264.7 giải phóng chất trung gian gây viêm trong đó có NO. Định lượng NO là cách đánh giá quá trình gây viêm và mức độ viêm. Mẫu thử có tác dụng chống viêm phải đáp ứng có khả năng ức chế giải phóng NO mà khơng gây độc tế bào.
❖ Chuẩn bị mẫu
Các mẫu các hợp chất này được pha thành dung dịch gốc với nồng 100mg/mL (đối với cao tổng, cao các phân đoạn) hoặc 100mM (đối với chất phân lập được) trong DMSO.
❖ Tiến hành
Tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 370C, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate. Sau đó chúng được ni cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2,5x105 tế bào/giếng. Tế bào được kích thích với 2µL LPS (0.1mg/mL) trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, được pha sẵn trong DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess. NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Độ hấp thụ được đo ở 570nm. Cardamonin được sử dụng làm mẫu đối chứng.
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ sung dung dịch MTT (0.5mg/ml pha trong PBS), ủ 4h ở 370C và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm.,[33] [45]
%Ư𝐶 = [[Xtb] (mẫu thử) – [Xtb](LPS)
[Xtb] (Control) – [Xtb](LPS) × 100]
Trong đó:
[Xtb]: nồng độ NO trung bình, được tính tốn dựa vào đường chuẩn NaNO2 - Tính giá trị CS% (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ thử của mẫu Giá trị CS(%) được tính theo cơng thức:
𝐶𝑆% = [OD (mẫu thử) – OD (ngày 0)
OD (DMSO) – OD (ngày 0) × 100] ± 𝜎
Trong đó: OD: mật độ quang; σ: độ lệch tiêu chuẩn
σ được tính theo cơng thức:
𝜎 = √(∑ 𝑥𝑖− 𝑥̅)2 𝑛 − 1
Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i; x̅: giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại, sử dụng phần mềm Excel để tính giá trị IC50
Đại lượng đánh giá
Tác dụng ức chế NO trên đại thực bào RAW 264.7 được đánh giá qua giá trị IC50 và khả năng sống sót của tế bào. Giá trị IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% lượng NO sinh ra. Giá trị IC50 càng nhỏ thì mẫu có hoạt tính càng cao. Khả năng sống sót của tế bào càng thấp (dưới 70%) chứng tỏ mẫu có hoạt tính gây độc tế bào, giá trị IC50 khơng có ý nghĩa.
❖ Phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào
Sự tăng sinh tế bào và tác dụng gây độc tế bào của các cao chiết được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm dựa trên 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT). Dung dịch MTT (0,5 mg/mL) được thêm vào mỗi giếng và ủ trong 3 giờ. Sau đó, các chất nổi trên bề mặt ni cấy được loại bỏ, và các tinh thể formazan được hòa tan trong DMSO. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 540 nm bằng đầu đọc vi tấm (Máy quang phổ Epoch, Biotek, VT, USA).
Phần trăm khả năng sống sót của tế bào được tính bằng cơng thức
(% Khả năng tồn tại của tế bào) = (𝐴𝑆
% Ức chế = 100% - (% khả năng tồn tại của tế bào)
Trong đó: AS là độ hấp thụ của mẫu, AC là độ hấp thụ của đối chứng âm
2.3.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng lên enzyme α-amylase của dịch chiết phân đoạn và các chất tinh khiết phân lập được
Phương pháp được thực hiện theo phương pháp của Adisakwattana S và cộng sự (2009) [40]
Cách tiến hành:
Bước 1: Các mẫu thử được pha loãng thành các mức nồng độ: 100μg/mL, 500μg/mL Bước 2:
- Enzyme α-amylase pha trong dung dịch đệm phosphate pH = 7 ở nồng độ 0,5 U/mL.
- Tinh bột (1mg/mL). 50μL enzyme α-amylase 0,5 U/mL được ủ với 100 μL cao chiết ở các mức nồng độ khác nhau và 100μL dung dịch đệm phosphate pH = 7, ủ ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 10 phút.
Bước 3: Cho vào hỗn hợp phản ứng 250μL tinh bột 1 mg/mL và ủ ở nhiệt độ 370C trong 10 phút.
Bước 4: Hỗn hợp được thêm vào lần lượt 100μL HCl 1N để dừng phản ứng và 300 μL thuốc thử Iodine 0,1N để nhận biết lượng tinh bột còn lại dựa trên phản ứng màu xanh đặc trưng của phức hợp tinh bột-iodine.
Bước 5: Hỗn hợp được đo quang phổ ở bước sóng λ = 660 nm để xác định lượng tinh bột còn lại sau phản ứng. Song song, tiến hành đánh giá hiệu quả ức chế enzyme
α-amylase với đối chứng dương là acarbose ở các mức nồng độ tương ứng. Phần
trăm enzyme α-amylase bị ức chế (%): dựa vào lượng tinh bột ban đầu và lượng tinh bột còn lại sau phản ứng thông qua giá trị đo độ hấp thụ ánh sáng.
Phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế (%) = 𝐴𝑜−A1
𝐴𝑜 𝑥 100%
Trong đó:
Ao: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch đối chứng (lượng tinh bột ban đầu). A1: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột còn lại).
Tiến hành dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa % enzyme bị ức chế và nồng độ mẫu.
Đại lượng đánh giá
Dựa vào phương trình đường chuẩn xác định được giá trị IC50: được định nghĩa là nồng độ (mg/mL) của mẫu tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp, sử dụng phần mềm Excel để tính giá trị IC50.
2.3.4. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng lên enzyme α-glucosidase của dịch chiết phân đoạn và các chất tinh khiết phân lập được.
Phương pháp được thực hiện theo phương pháp của Assefa và cộng sự. [41]
❖ Nguyên tắc
Hình 2.6. Phản ứng thủy phân enzyme α-glucosidase với cơ chất là p-nitrophenyl α-D-
glucopyranosid
p-nitrophenyl α-D-glucopyranosid (pNPG) bị enzyme α-glucosidase thuỷ phân
thành p-nitrophenol. Xác định lượng sinh ra bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 401nm.
❖ Tiến hành
Mẫu được hoà tan trong đệm phosphat, thêm 100µL enzyme, lắc đều, ủ ở 37°C trong 5 phút, sau đó thêm 100µL dung dịch p-nitrophenyl α-D-glucopyranosid (pNPG), lắc đều, ủ ở 37°C trong 15 phút, cuối cùng thêm dung dịch Na2CO3 và đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 401nm. Tiến hành thử hoạt tính trên các mẫu thử với các nồng độ khác nhau, chất đối chứng dương là acarbose.
- Các mẫu cao chiết, chất sạch được pha trong đệm KPP (0.1M; pH 6.8):DMSO (1:1) - 50L mẫu được ủ với 100L dung dịch enzyme -glucosidase (pha bằng đệm KPP 0.1M; pH 6.8) trong giếng đĩa 96 tại nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Sau thời gian này, 50L dung dịch cơ chất p-NPG (pha trong đệm KPP 0.1M; pH 6.8) được thêm vào và ủ thêm 5 phút.
- Mật độ quang được đọc tại bước sóng 401nm.
❖ Cơng thức tính
Chỉ số đánh giá: (%Ư𝐶) = (1 −𝑂𝐷𝑡ℎ
𝑂𝐷𝑐ℎ) 𝑥 100%
Khả năng ức chế α glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế (I%)
I% = 𝐴𝑜−As
𝐴𝑜 𝑥 100% ❖ Đại lượng đánh giá
Tác dụng ức chế α-glucosidase được đánh giá qua giá trị IC50. Mẫu có hoạt tính
càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Sử dụng phần mềm Excel để tính giá trị IC50 .
2.4. Nơi thực hiện đề tài
❖ Quá trình chuẩn bị mẫu thử nghiệm hoạt tính sinh học được thực hiện ở bộ mơn Dược học cổ truyền.
❖ Quá trình đánh giá các hoạt tính sinh học được thực hiện ở phịng “Thí nghiệm cơng
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ BÀN LUẬN
3.1. Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 của các cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được của các cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được
9 mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, phân đoạn n-hexan của lá, phân đoạn ethyl
acetat của lá, phân đoạn n-butanol của lá, phân đoạn nước của lá và các chất phân lập được gồm HR1, HR2, HR3, HB3 được đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO từ tế bào RAW 264.7 được mô tả trong mục 2.2.2. Kết quả tác dụng ức chế giải phóng NO từ tế bào RAW 264.7 được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sàng lọc khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS các mẫu Hồng. Mẫu Nồng độ (g/mL) % Ức chế NO % Tế bào sống Control 100 ± 1,48 100 ± 0,64 LPS 0 ± 4,96 72,79 ± 1,47 Cardamonin* 3 16,77 ± 2,77 88,04 ± 0,84 10 91,44 ± 4,41 95,83 ± 4,02 HR Hex 30 0 ± 1,92 77,46 ± 1,83 100 0,7 ± 2,28 78,35 ± 1,75 HR EA 30 29,86 ± 2,93 95,96 ± 3,57 100 69,26 ± 1,57 60,37 ± 0,60 HR Bu 30 0,76 ± 4,28 71,09 ± 2,22 100 9,30 ± 2,24 73,81 ± 1,22 HR H2O 30 0 ± 2,13 81,38 ± 1,12 100 0 ± 5,64 66,86 ± 1,40 Cao tổng 30 0 ± 5,63 72,82 ± 1,30 100 0 ± 2,30 83,43 ± 0,14 HR1 30 99,75 ± 2,57 5,27 ± 1,42 100 95,63 ± 0,63 4,69 ± 1,46 HR2 30 31,08 ± 3,20 80,84 ± 3,20 100 36,84 ± 2,35 82,26 ± 5,58 HR3 30 6,39 ± 0,74 85,45 ± 0,36 100 12,96 ± 0,96 70,98 ± 0,45 HB3 30 1,01 ± 3,62 72,47 ± 0,18 100 6,66 ± 5,86 66,37 ± 2,25
*Cardamonin được dùng làm chuẩn dương
Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy phân đoạn ethyl acetat có giá trị SC ức
chế NO > 50%, mẫu này được tiếp tục tìm giá trị IC50. Các phân đoạn và hợp chất cịn lại có giá trị SC ức chế NO <50% khơng tìm IC50. Hợp chất HR1 có giá trị SC ức chế NO > 50%, tuy nhiên làm hợp chất này có tác dụng gây độc tế bào (% Tế bào sống sót là <10%) nên khơng tiếp tục tìm IC50.
Bảng 3.2. IC50 khả năng ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS Mẫu Nồng độ (g/mL) % Ức chế IC50 % Tế bào sống Control - 100 ± 4,78 LPS - 0 ± 5,05 Cardamonin* 0.625 1.07 ± 151 4,81 ± 0,05 g/mL 66,15 ± 1,39 1.25 8,40 ± 1,29 72,44 ± 1,70 2.5 12,93 ± 3,32 75,61 ± 1,72 5 49,86 ± 3,62 82,91 ± 2,05 10 98,63 ± 2,12 90,95 ± 0,62 HR.EA 25 0,76 ± 1,55 91,55 ± 1,25 g/mL 77,22 ± 3,05 50 21,22 ± 0,89 81,85 ± 2,44 75 35,08 ± 1,76 67,03 ± 1,40 100 61,30 ± 2,24 48,37 ± 0,60 150 70,18 ± 0,77 35,81 ± 0,90
Bảng 3.3. Giá trị IC50 của cao phân đoạn và hợp chất phân lập được
HR.EA Cardamonin
IC50 (µg/mL) 91,55 4,81 ± 0.05
SD 1,25 0,05
Hệ số tương quan (R2) 0,991 0,987
Nhận xét
Về tác dụng ức chế sản sinh NO của tế bào RAW 264.7 của cao phân đoạn ethyl acetat và hợp chất HR1 có tác dụng ở nồng độ thử nghiệm. Với giá trị IC50 của phân đoạn ethyl acetat là 91,55g/mL, có tác dụng kém hơn đối chứng dương Cardamonin (4,81 g/mL) cho thấy cao phân đoạn ethyl acetat kém hơn 19,5 lần. Đối với cao phân đoạn ethyl acetat ở liều 30g/mL tế bào sống sót 95,96% và ở liều 100g/mL tế bào sống sót 60,37%.
Hệ số tương quan của cao phân đoạn ethyl acetat (0,991) lớn hơn 0,90, chứng tỏ nồng độ và SC% (%ức chế NO) tỷ lệ thuận và chặt chẽ, nghĩa là khi tăng nồng độ thì khả năng ức chế NO cũng tăng theo.
Kết quả sàng lọc đánh giá tác dụng ức chế NO trên tế bào RAW 264.7 cho thấy đa số các nồng độ thử đối với phân đoạn EtOAc có tỷ lệ tế bào sống sót dưới 80% nhưng vẫn tiếp tục thử nghiệm phân đoạn EtOAc với mục đích để bổ sung cơ sở dữ liệu và giải thích các mẫu chất có tác dụng ức chế NO mạnh lại có độc tính với tế bào nên tác dụng này ít có ý nghĩa.
3.2. Đánh giá ảnh hưởng trên enzyme -amylase
9 mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, phân đoạn n-hexan của lá, phân đoạn ethyl acetat của lá, phân đoạn n-butanol của lá, phân đoạn nước và các hợp chất phân lập được là HR1, HR2, HR3, HB3 được đánh giá tác dụng ức chế enzyme -amylase được mô tả trong mục 2.2.3
Bảng 3.4. Sàng lọc khả năng ức chế enzyme -amylase
Mẫu Nồng độ (g/mL) % Ức chế enzyme -amylase
Control 0 ± 1,94 Acarbose* 25 25,97 ± 0,95 50 41,77 ± 0,57 100 43,64 ± 1,70 Cao toàn phần 100 10,54 ± 1,49 500 13,69 ± 1,28 HR Hex 100 11,41 ± 1,59 500 13,72 ± 0,02 HR EA 100 8,19 ± 3,20 500 11,71 ± 0,41 HR Bu 100 0 ± 1,32 500 17,01 ± 2,27 HR H2O 100 6,30 ± 0,88 500 6,07 ± 0,28 HR1 100 20,45 ± 0,36 500 25,96 ± 0,66 HR2 100 15,22 ± 0,97 500 25,27 ± 1,00 HR3 100 14,78 ± 0,96 500 22,36 ± 0,41 HB3 100 10,71 ± 2,11 500 16,39 ± 2,91
*Acarbose được dùng làm chuẩn dương
Nhận xét: Kết quả cho thấy cao toàn phần, cao phân đoạn n-hexan, cao phân đoạn
ethyl acetat, cao phân đoạn n-butanol, phân đoạn nước và hợp chất HR1, HR2, HR3, HB3 đều có giá trị khả năng ức chế enzyme -amylase < 50%. Do đó khơng tiến hành
thử nghiệm tìm giá trị IC50, các mẫu khơng biểu hiện tác dụng ức chế enzyme -amylase ở nồng độ thử nghiệm.
3.3. Đánh giá ảnh hưởng trên enzyme -glucosidase
9 mẫu thử bao gồm cao chiết toàn phần, phân đoạn n-hexan của lá, phân đoạn ethyl acetat của lá, phân đoạn n-butanol của lá, phân đoạn nước và các chất tinh khiết là HR1, HR2, HR3, HB3 được đánh giá tác dụng ức chế -glucosidase được mô tả trong mục 2.2.3. Kết quả tác dụng ức chế enzyme -glucosidase được trình bày trong Bảng 3.5
Bảng 3.5. Sàng lọc khả năng ức chế -glucosidase Mẫu Nồng độ (g/mL) -glucosidase % Ức chế Mẫu Nồng độ (g/mL) -glucosidase % Ức chế Control 0 ± 1,53 Acarbose* 100 14,21 ± 1,38 200 39,23 ± 2,12 600 62,28 ± 0,06 Cao toàn phần 50 38,68 ± 2,34 200 76,25 ± 1,67 HR Hex 50 8,94 ± 1,12 200 40,13 ± 3,23 HR EA 50 35,02 ± 1,89 200 69,96 ± 2,67 HR Bu 50 16,88 ± 3,45 200 86,48 ± 2,89 HR H2O 50 0 ± 1,46 200 0,57 ± 0,56 HR1 50 30,62 ± 0,64 200 36,99 ± 0,41