Cao toàn
phần HR.EA HR-Bu HR3 Acarbose
IC50 (g/mL) 106,31 106,31 116,36 52,19 436,13 SD 1.83 1,45 1,85 1,56 3,65 Hệ số tương quan 0.965 0,974 0,987 0,901 0,994 Số điểm phân tích 5 5 5 5 5 Nhận xét
Hệ số tương quan của cao toàn phần (0,975), cao phân đoạn ethyl acetat (0,974),
n-butanol (0,987) và hợp chất phân lập được HR3 (0,901) lớn hơn 0,90 chứng tỏ nồng
độ và SC% (% ức chế -glucosidase) tỷ lệ thuận và chặt chẽ, nghĩa là khi tăng nồng độ thì khả năng ức chế -glucosidase cũng tăng theo.
Về tác dụng ức chế -glucosidase của cao tổng, cao phân đoạn HR.EA, cao phân đoạn HR-Bu và hợp chất HR3 có tác dụng ở nồng độ thử nghiệm. Kết quả thu được cho thấy cao tổng, cao phân đoạn ethyl acetat có giá trị IC50 = 106,31 g/mL, cao phân đoạn
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Về đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO trên đại thực bào RAW 264.7
Xuất phát từ kinh nghiệm dân gian và những nghiên cứu đã công bố trên thế giới, một trong những tác dụng nổi bật của loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris
Makino là chống viêm [34], [5], vấn đề nghiên cứu thành phần hóa học và sàng lọc tác dụng ức chế giải phóng NO trên tế bào RAW 264.7 đã được đặt ra nhằm đánh giá khả năng chống viêm của lá Hồng. Phương pháp thử nghiệm tác dụng chống viêm in vitro mà đề tài sử dụng có ưu điểm là độ nhạy cao, đặc hiệu, thuận tiện và hiệu quả trong việc sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng viêm. Đây cũng là phương pháp được sử dụng phổ biến trên thế giới trong nghiên cứu sàng lọc hợp chất kháng viêm. Kết quả thử nghiệm chống viêm in vitro của cao tổng, cao phân đoạn và 1 chất tinh khiết, cho thấy cao phân đoạn ethyl acetat thể hiện khả năng ức chế sản sinh NO của tế bảo RAW 264.7 (kích thích bằng LPS) khác nhau ở nồng độ thử nghiệm. Với giá trị IC50 = 91,55 g/mL có tác dụng ức chế NO trên tế bào RAW 264.7 nhưng lại gây độc tế bào. Kết quả này cũng góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về tác dụng ức chế NO trên tế bào RAW 264.7 của cây Hồng, từ đó tiếp tục đánh giá độc tính của các dịch chiết phân đoạn và các chất phân lập được.
Các kết quả này cũng phù hợp với các công bố trước đây về tác dụng chống viêm của loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino, không chỉ thêm minh chứng khoa học về tác dụng chống viêm của Hồng mà còn làm rõ hơn cơ chế chống viêm của dược liệu này là ức chế sản sinh Nitric oxid của tế bào RAW 264.7. Đối với mẫu hợp chất HB3 (đã được xác định là mearnsitrin), mặc dù vẫn có mối liên hệ giữa nồng độ và phần trăm ức chế sinh NO, tại các nồng độ khảo sát, mẫu chất này không thể hiện rõ khả năng ức chế sinh NO hoặc gây độc tế bào RAW 264.7. Điều này phần nào phù hợp với nghiên cứu của Byoung Ok Cho và cộng sự đã chứng minh rằng hợp chất mearnsitrin phân lập từ lồi Diospyros lotus L. [36] khơng thể hiện khả năng ức chế sản sinh NO ở các nồng độ nghiên cứu với giá trị IC50 >100µg/ml. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, hợp chất này thể hiện tác dụng chống viêm bằng cách khác là ức chất trung gian TNF-
α, IL-1β, IL-6 và cyclooxygenase-2 (COX-2) trên tế bào RAW 264.7 ở mơ hình chuột.
Từ đây gợi mở hướng nghiên cứu các mơ hình thử in vitro khác như ức chế các yếu tố gây viêm COX, TNF-α, IL-1β, IL-6 để đánh giá khả năng chống viêm của chất này từ cây Hồng.
4.2. Về đánh giá ảnh hưởng lên enzyme α-amylase
Khóa luận thực hiện đánh giá hoạt tính ức chế enzyme amylase của các mẫu cao toàn phần, cao phân đoạn n-hexan của lá, cao chiết phân đoạn ethyl acetat của lá, cao phân đoạn n-butanol của lá, cao phân đoạn nước, các chất phân lập được HR1, HR2, HR3 và HB3. Kết quả cho thấy, tại nồng độ thử nghiệm, tất cả các mẫu khơng biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme amylase. So sánh kết quả của luận văn với các nghiên cứu trên, nhận thấy đánh giá tác dụng hạ đường huyết bằng phương pháp ức chế enzyme amylase chưa được thử nghiệm với các phân đoạn và các chất phân lập được từ loài Diospyros
kaki Thunb. var. silvestris Makino. Vì vậy, nghiên cứu mong muốn sàng lọc hoạt tính
ức chế enzyme amylase này để bổ sung cơ sở dữ liệu hoạt tính ức chế enzyme cho lồi
Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino cũng như chi Diospyros L.
Đối với 4 hợp chất phân lập được là acid ursolic (HR1), corchoionol C (HR2), acid betulinic (HR3) và mearnsitrin (HB3) hiện nay chưa ghi nhận các nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase của hợp chất corchoionol C.
4.3. Về đánh giá ảnh hưởng trên enzyme a- glucosidase
Các nghiên cứu chỉ ra rằng α-glucosidase là một enzyme chính trong quá trình
chuyển hóa carbohydrat. Glucosidase là một loại enzyme rất cần thiết cho hệ tiêu hóa, thuộc nhóm enzyme thủy phân. α-glucosidase là dạng chủ yếu của enzyme glucosidase, được tìm thấy ở người và các động vật có vú khác, giúp thủy phân liên kết alpha của các polysaccharide như tinh bột và glycogen, tạo ra những cơ chất đơn giản như glucose và maltose. Ngày càng có nhiều hướng tiếp cận điều trị đái tháo đường bằng cách ức chế hoạt động của các enzyme này trong q trình tiêu hóa thức ăn, giảm tốc độ tiêu thụ carbohydrate của cơ thể.
Ức chế α-glucosidase có thể làm chậm quá trình phân hủy và hấp thu các
carbohydrat vào máu, từ đó hạn chế tăng nồng độ glucose trong máu sau ăn. Kết quả đánh giá trên mơ hình thực nghiệm in vitro, kết quả ức chế enzyme α-glucosidase cho thấy cao phân đoạn ethyl acetat, n-butanol và 1 hợp chất HR3 thể hiện khả năng ức chế enzyme α-glucosidase tại nồng độ thử nghiệm. Cao toàn phần, cao phân đoạn ethyl
acetat có giá trị IC50 = 106,31 g/mL, cao phân đoạn n-butanol có giá trị IC50 = 116,36 g/mL, hợp chất HR3 có giá trị IC50 = 52,19 g/mL. Các kết quả này cũng cho thấy có
tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase, phù hợp với các công bố trước đây về tác dụng hạ đường huyết của loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino như sau.
Năm 2011, nghiên cứu của Shruti Sancheti và cộng sự đã cho thấy cao chiết lá của loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino bằng ethanol có tác dụng ức chế
enzyme -glucosidase với giá trị IC50 bằng 32 g/mL [16].
Từ kết quả thu được và các tài liệu tham khảo đã chứng minh loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino có hoạt tính ức chế α-glucosidase, đã bổ sung dữ liệu về hoạt tính ức chế α-glucosidase cho loài Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ kết quả của nghiên cứu, đề tài đã rút ra một số kết luận sau:
1. Hoạt tính ức chế NO trên tế bào RAW264.7 của các phân đoạn và các chất tinh khiết:
Đã đánh giá tác dụng ức chế NO trên tế bào RAW264.7 của các phân đoạn và các hợp chất phân lập được. Phân đoạn ethyl acetat biểu hiện có hoạt tính ức chế NO trên tế bào RAW264.7 với giá trị IC50 là 91,55 g/mL, nhưng gây độc cho tế bào (tế bào sống sót bằng 35,81% khi ở nồng độ 150g/mL).
2. Hoạt tính ức chế enzyme α–glucosidase và ức chế enzyme α-amylase trên các phân đoạn và các chất tinh khiết:
Đã đánh giá tác dụng ức chế enzyme α–glucosidase và ức chế enzyme α-amylase của các phân đoạn và các hợp chất phân lập được. Cao toàn phần, cao phân đoạn ethyl acetat, cao phân đoạn n-butanol và 1 hợp chất acid betulinic (HR3) biểu hiện hoạt tính ức chế ức chế enzyme α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 106,31 g/mL, 116,36 g/mL, 52,19 g/mL.
Khơng có mẫu nào biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme α-amylase tại nồng độ thử
nghiệm.
Từ kết luận trên, đề tài có những kiến nghị sau:
1. Đánh giá thêm tác dụng chống viêm theo cơ cế khác như ức chế COX, ức chế các chất trung gian gây viêm TNF-α, IL-1β, IL-6.
2. Tiếp tục đánh giá các hợp chất phân lập được với tác dụng sinh học khác nhau như tác dụng gây độc tế bào, kháng khuẩn, ...
3. Sàng lọc và đánh giá các hoạt tính sinh học tiềm năng khác của cây Hồng
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng -tập 1, , NXB Khoa học và kỹ thuật, TP. Hồ Chí Minh, pp.
2. Nguyễn Hồng Thịnh (2022), Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây hồng rừng (Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino) và đánh giá một số hoạt tính sinh học In vitro, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội. 3. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam -tập 1,, Nhà
xuất bản Khoa học và kỹ thuật., Hà Nội, pp.
4. Văn Thùy Linh (2019), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb var. siveltris Makino) thu hái tại Sapa, Lào Cai.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
5. Xie Chunyan., Xie, Zhisheng (2015), "Persimmon (Diospyros kaki L.) leaves: A
review on traditional uses, phytochemistry and pharmacological properties", Journal of ethnopharmacology, 163, pp.
6. Xie C Z Xie, et al. (2015), "Persimmon (Diospyros kaki L.) leaves: a review on
traditional uses, phytochemistry and pharmacological properties", J Ethnopharmacol, 163, pp. 229-240.
7. Wu Z. Y., Raven P. H., H., ong D. Y. (1996), "Flora of China Editorial
Committee, Science Press & Missouri Botanical Garden Press", Beijing & St. Louis, 13, pp.
8. Uddin G., Rauf A., et al. (2014), "Anti-nociceptive, anti-inflammatory and
sedative activities of the extracts and chemical constituents of Diospyros lotus
L", Phytomedicine, 21(7), pp. 954-959.
9. Trongsakul S., Panthong A., et al. (2003), "The analgesic, antipyretic and anti-
inflammatory activity of Diospyros variegata Kruz", Journal of Ethnopharmacology, 85(2), pp. 221-225.
10. Tezuka M., Kuroyanagi M., et al. (1972), "Naphthoquinone Derivatives from the
Ebenaceae. IV. aphthoquinone Derivatives from Diospyros kaki THUNB. and D. kaki THUNB. var. sylvestris Makino", Chemical and Pharmaceutical Bulletin,
20(9), pp. 2029-2035.
11. Tang D., Zhang Q., et al. (2019), "Number of Species and Geographical
Distribution of Diospyros L. (Ebenaceae) in China", Horticultural Plant Journal, 5(2), pp. 59-69.
12. Takhtajan Armen L. (2009) "", , (2009), "Flowering Plants", Sringer, pp.
13. SUN Y., TAN H., LAN X. (2009), "Protective Effect of Persimmon Flavone Pretreatment on Rat Myocardial Ischemic and Reperfusion Injury", Journal of Ji
Ning Medical College, 32(1), pp. 9-11.
14. Sun L., Zhang J., et al. (2011), "Evaluation to the antioxidant activity of total flavonoids extract from persimmon (Diospyros kaki L.) leaves", Food Chem Toxicol, 49(10), pp. 2689-2696.
15. Shugang L., Michael G. G., Frank W. (1996), "Ebenaceae ", Flora of China, 15, pp. 215-234.
16. Sancheti Shruti., Sancheti, Sandesh., et al (2011), "Persimmon leaf (Diospyros
kaki), a potent α- glucosidase inhibitor and antioxidant: Alleviation of
postprandial hyperglycemia in normal and diabetic rats", Journal of Medicinal
Plants Research, 5, pp.
17. Rauf A. Uddin G. Patel, S.Khan, A. Halim, S. A. Bawazeer, S.Ahmad, K. Muhammad, N. Mubarak, M. S. (2017), "Diospyros, an under-utilized, multi- purpose plant genus: A review", Biomed Pharmacother, 91, pp. 714-730.
18. Rathore K., Singh V. K., et al. (2014), "In-vitro and in-vivo antiadipogenic, hypolipidemic and antidiabetic activity of Diospyros melanoxylon (Roxb)",
Journal of Ethnopharmacology, 155(2), pp. 1171-1176.
19. Qin F. Z. Lin X., et al. (2008), "The hypotensive effects of persimmon leaf flavonoids", Modern Traditional Chinese Medicine 28(1), pp. 61-63.
20. Paknikar S. K., Fondekar K. P., et al. (1996), "4-hydroxy-5-methylcoumarin derivatives from Diospyros kaki Thunb and D. Kaki Thunb var. sylvestris Makino structure and synthesis of 11-methylgerberinol.", Phytochemistry, 41(3), pp. 991- 993.
21. Morel I., Lescoat G. et al. (1993), "Antioxidant and iron-chelating activities of the flavonoids catechin, quercetin and diosmetin on iron-loaded rat hepatocyte cultures", Biochemical Pharmacology, 45(1), pp. 13-19.
22. Mallavadhani, U. V., et al. (1998), "Pharmacology and chemotaxonomy of
diospyros", Phytochemistry, 38(4), pp. 901-951.
23. Lin S. R. Wang J. L., Wu X. N. (1996), "Study on the antioxidant and antiatheroscloresis activity of Diospyros kaki leaves tea", Strait Pharmaceutical
Journal 8, pp. 14-15.
24. Liang C., Fu F. M., Zhang K. S. (1985), "The pharmacological effects of persimmon leaf on cardiovascular system", Yaoxue Tongbao, 20(4), pp. 245. 25. Lee K. Y., Jung J. Y., et al. (2012), "Diospyros blancoi Attenuates Asthmatic
Effects in a Mouse Model of Airway Inflammation", Inflammation, 35(2), pp.
623-632.
26. Lee J. S., Lee M. K., et al. (2006), "Supplementation of whole persimmon leaf improves lipid profiles and suppresses body weight gain in rats fed high-fat diet",
Food Chem Toxicol, 44(11), pp. 1875-1883.
27. Kim H. H., Kim D. S., et al. (2013), "Inhibitory effects of Diospyros kaki in a
model of allergic inflammation: Role of cAMP, calcium and nuclear factor-κB",
Int J Mol Med, 32(4), pp. 945-951.
28. Kim, K. A., et al. (2016), "The leaves of Diospyros kaki exert beneficial effects on a benzalkonium chloride induced murine dry eye model", Mol. Vis, 22, pp.
284-293.
29. Kameda K., Takaku T., et al. (1987), "Inhibitory effects of various flavonoids isolated from enzyme activity", Journal of Natural Products, 50(4), pp. 680-683. 30. Huang S. L. Chen L. F., et al. (1983), "Alcohol extracts of Diospyros kaki leaves' influence on the heart function and hemodynamics of anaesthetic dogs", Guang
Xi Yi Xue, 5, pp. 230-232.
31. Han K. H., Han D. C. et al. (1983), "Pharmacological effect and clinical
application of Diospyros kaki leaves", Research on Zhong Cheng Yao 7, pp. 27-
28.
32. Funayama S. Hikino H. (1979), "Hypertensive principles of Diospyros kaki
33. Dirsch, Verena M., et al. (1998), "The Griess assay: suitable for a bio-guided fractionation of anti-inflammatory plant extracts", Planta medica, 64(05), pp.
423-426.
34. Direito R.., Rocha, J. (2020), "Anti-inflammatory Effects of Persimmon (Diospyros kaki L.) in Experimental Rodent Rheumatoid Arthritis", 17(6), pp. 663-683.
35. Dewanjee S., Maiti A., et al. (2011), "Effective Control of Type 2 Diabetes through Antioxidant Defense by Edible Fruits of Diospyros peregrina",
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011, pp. 1-7.
36. Cho B. O., Yin H. H., et al. (2016), "Anti-inflammatory activity of myricetin from Diospyros lotus through suppression of NF-κB and STAT1 activation and Nrf2-mediated HO-1 induction in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 80(8), pp. 1520-
1530.
37. Chen L. I., Guo Y., et al. (2020), "Total Flavonoids Isolated from Diospyros kaki L. f. Leaves Induced Apoptosis and Oxidative Stress in Human Cancer Cells",
Anticancer Res, 40(9), pp. 5201-2010.
38. Batchelor D. B., Carter M. D., et al. (1987), "Coupled model of wave damping, quasilinear heating, and radial transport applied to bumpy tori", Physical Review
Letters 58, 58(25), pp. 2664.
39. Adzu B., Amos S., et al. (2002), "Pharmacological evidence favouring the folkloric use of Diospyros mespiliformis Hochst in the relief of pain and fever",
Journal of Ethnopharmacology, 82(2), pp. 191-195.
40. Adisakwattana S., Chantarasinlapin, P., Thammarat, H.,Yibchok-Anun, S. (2009), "A series of cinnamic acid derivatives and their inhibitory activity on intestinal alpha-glucosidase", J Enzyme Inhib Med Chem, 24(5), pp. 1194-200. 41. Assefa S. T., Yang E. Y., et al. (2019), "Alpha Glucosidase Inhibitory Activities
of Plants with Focus on Common Vegetables", Plants (Basel), 9(1), pp.
42. Cheenpracha S., Park E. J., et al. (2010), "Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin A", Mar Drugs, 8(3), pp. 429-37.
43. S.K. Paknikar, K.P. Pai Fondekar, et al. (1998), "4-Hydroxy-5-methylcoumarin derivatives from Diospyros kaki Thunb and D. kaki var. Sylvestris makino;
structure and synthesis of 11-methylgerberinol", pp.
44. Carine Mvot Akak, Céline Mbazoa Djama, et al. (2010), "New coumarin glycosides from the leaves of Diospyros crassiflora (Hiern)", pp.
45. Berridge M. V., Herst P. M., et al. (2005), "Tetrazolium dyes as tools in cell
biology: new insights into their cellular reduction", Biotechnol Annu Rev, 11, pp.
127-52.
46. Kawakami K., Aketa S., et al. (2010), "Major water-soluble polyphenols, proanthocyanidins, in leaves of persimmon (Diospyros kaki) and their alpha- amylase inhibitory activity", Biosci Biotechnol Biochem, 74(7), pp. 1380-5. 47. Kim K. S., Lee D. S., et al. (2016), "Anti-Inflammatory Effects and Mechanisms
of Action of Coussaric and Betulinic Acids Isolated from Diospyros kaki in Lipopolysaccharide-Stimulated RAW 264.7 Macrophages", Molecules, 21(9),
48. C M. Gonzalez, Hernando I., et al. (2021), "In Vitro and In Vivo Digestion of Persimmon and Derived Products: A Review", Foods, 10(12), pp.