CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM
3.3. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome
3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome
Canthaxanthin và α-tocopherol được đưa lên liposomes bằng phương pháp bay hơi màng mỏng như đã mô tả trước đây [108]. Hỗn hợp canthaxanthin và α-tocopherol có tỷ lệ khối lượng cố định 1:9 (hỗn hợp A) được hòa tan trong 2ml diclometan cùng với lecithin đậu nành. Các nồng độ ban đầu (IC = mcanthaxanthin/mlipid, %wt/wt) của canthaxanthin được chọn lần lượt là 0.1%; 0.5% và 1.0%. Sau khi hòa tan, màng mỏng thu được bằng cách loại bỏ dung môi hữu cơ trong nồi cách thủy ở 300C dưới áp suất bình 250 mbar và tốc độ quay cấp 2. Nước cất (4ml) được thêm vào để bóc màng, tạo thành liposome có chứa canthaxanthin. Để có được kích thước cố định, liposome được đưa qua màng polycacbonate 100nm trong máy đùn mini 50 lần. Mẫu cuối cùng được đựng trong eppendorf và giữ trong tủ lạnh (khoảng 40C trong bóng tối). Tất cả các mẫu khác (liposome, liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol) được chuẩn bị với cùng một quy trình và tỷ lệ nguyên liệu tương ứng. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol được thể hiện trong Hình 3.3.1.
Hình 3.3.1. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol
3.3.2. Kích thước hạt
Chỉ số z trung bình, kích thước trung bình và chỉ số phân tán (PDI) của các mẫu liposome được theo dõi bằng cách sử dụng máy đo kích thước hạt nano SZ-100 và
máy phân tích thế zeta (Horiba, Nhật Bản) với laser He/Ne (λ=633 nm) và tán xạ góc 900. Kết quả thu được là giá trị trung bình của ít nhất ba lần đo.
3.3.3. Q trình đưa canthaxanthin lên liposome
Hiệu suất đóng gói (EE%) và khối lượng tải thuốc (DL%) được xác định bằng máy quang phổ UV-Vis. Canthaxanthin dư thừa đã được loại bỏ bằng thẩm tách (14000Da, 10 cm x 10 cm). Huyền phù được thẩm tách trong 24 giờ với 1 lít nước cất. Nước cất được thay sau mỗi 2 giờ kể từ khi bắt đầu cho 4 lần. Liposome được hòa tan trong 3.5ml hexan và được siêu âm trong 2 phút để phá hủy huyền phù liposome. Sau đó 100 µl hỗn hợp liposome được trộn với 2900µl hexan và được lắc trong 30 giây. Lượng canthaxanthin tự do được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ bằng máy quang phổ Hitachi U-2900 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) ở bước sóng 474nm với n- hexan làm mẫu đối chứng. (EE%) và (DL%) được xác định tương ứng bằng các phương trình sau:
3.3.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc
Lấy 1 ml liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol được đặt vào túi thẩm tách (ngưỡng trọng lượng phân tử =14000 Da), tiếp theo là ủ trong 50ml dung dịch đệm phosphat (PBS) (pH=7.4) có chứa Tween 80 (0.5%) (wt) ở 370C và lắc nhẹ (100 vòng/phút). Sau một khoảng thời gian nhất định, 1ml mẫu được lấy từ túi và một thể tích đệm mới giống hệt được thêm vào. Mơi trường được lấy ra và phân tích bằng cách sử dụng máy quang phổ UV-Vis để tính lượng canthaxanthin được giải phóng. Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần và được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD).
3.3.5. Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân 3.3.5.1. Cá và chế độ ăn 3.3.5.1. Cá và chế độ ăn
Ảnh hưởng của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol trong chế độ ăn bổ sung cho cá hồi vân đã được khảo sát tại Trung tâm Nghiên cứu Cá nước lạnh Sa Pa, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (Lào Cai, Việt Nam). Tổng cộng có 900 con cá được cân riêng và phân bổ ngẫu nhiên vào 30 bể (mỗi bể 280 lít). Mỗi bể chứa
uống, cá được ni với thức ăn khơng có màu để màu cơ của chúng trở lại màu ban đầu. Sau đó, mỗi bể trong mỗi nhóm được cho ăn một trong mười khẩu phần thí nghiệm trong 3 tháng (Bảng 3.3.1). Thức ăn thơ sử dụng trong thí nghiệm do Nhà máy thức ăn chăn nuôi Kinh Bắc, tỉnh Bắc Ninh, Việt Nam sản xuất với thành phần dinh dưỡng cơ bản như sau: đạm 40%, chất béo 18%, chất xơ thô 5%, năng lượng 3800kcal/kg. Cá được cho ăn lúc 6 giờ sáng, 10 giờ sáng, 2 giờ chiều và 6 giờ chiều hàng ngày cho đến khi no. Nước trong bể được thay liên tục bằng nước ngọt với tốc độ 4l/phút. Nhiệt độ nước và oxy hịa tan được duy trì trong khoảng từ 6 đến 17.50C và từ 10 đến 11ppm tương ứng. Máy bơm khơng khí được sử dụng để sục khí vào nước.
Bảng 3.3.1. Thành phần thức ăn cho cá được sử dụng trong thử nghiệm
Khẩu phần dinh dưỡng
Khối lượng (mg) Lecithin α-
tocopherol Canthaxanthin
Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương mại - - -
Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg lecithin
1000 - -
Chế độ III Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol
- 100 -
Chế độ IV Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 20mg/kg canthaxanthin
- - 20
Chế độ V Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 100mg/kg α-tocopherol và 20mg/kg canthaxanthin
- 100 20
Chế độ VI Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1 g/kg α-tocopherol loaded liposomes
990 10 -
Chế độ VII
Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin trên liposomes (IC=1%)
990 - 10
Chế độ VIII
Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.1%)
990 9 1
Chế độ IX Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=0.5%)
950 45 5
Chế độ X Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1g/kg canthaxanthin và α-tocopherol trên liposomes (IC=1%)
3.3.5.2. Tiến hành đo khối lượng
Trong quá trình thử nghiệm, cá được cân định kỳ hàng tháng bằng cách lấy trọng lượng trung bình của ba con cá được bắt ngẫu nhiên từ mỗi nhóm. Các chỉ số sinh trưởng của cá được xác định như sau:
Trọng lượng tăng (WG, %) = (Wf - Wi)/Wi) × 100
Tốc độ tăng trưởng cụ thể (SGR) g/ngày = 100 (ln Wf - ln Wi)/t Trong đó:
Wf là trọng lượng cơ thể cuối cùng (g), Wi là trọng lượng cơ thể ban đầu (g) và t là thời gian thí nghiệm (ngày).
3.3.5.3. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi
Sau ba tháng với chế độ ăn thử nghiệm, phi lê cá được thu thập và đo màu bằng máy so màu Salmofan Lineal (DSM Nutritional Products, Kaiseraugst, Thụy Sĩ) trên thang điểm từ 20 đến 34, đây là tiêu chuẩn quốc tế được chấp nhận cho màu cá hồi (Hình 3.3.2). Điểm số được ghi lại cho mỗi mẫu được ba nhà nghiên cứu thống nhất.
Hình 3.3.2. Máy đo màu DSM SalmoFan
Sự phân bố canthaxanthin trong mô cơ của cá được xác định như sau. Đầu tiên, các mẫu cơ được thu thập trên lưng cá và bảo quản ở -200C. Sau đó, canthaxanthin được chiết xuất theo quy trình được mơ tả trước đó. Tóm lại, sau khi được nghiền bằng thiết bị đồng nhất ULTRA-TURRAX® của IKA, các mẫu được chiết xuất bằng dung mơi hữu cơ, sau đó làm sạch và phân tích bằng máy sắc ký HPLC với chất chuẩn canthaxanthin của Sigma Aldrich. Hệ thống sắc ký khí lỏng sử dụng cột phân tích C- 18 Hypersil Gold (5 µm, 150mm x 4.6 mm), tốc độ dòng được cài đặt 1ml/phút. Thời gian lưu là 6 phút. Quy trình được thực hiện tại phịng phân tích của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.