Sau khi loại bỏ các biến khơng có ý nghĩa (p > 0.05) Hàm mục tiêu Y1, Y2 của mơ hình cũng được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:
Y1 = 14.94 + 0.61B – 0,43C + 0.5D – 0.69AC + 0.77BC + 1.13BD + 0.74CD –
0.98A2 – 2.04B2 – 1.94C2 – 1.36D2 (1)
Y2 = 18.07 + 0.79B – 0.58C + 0.64D – 0.83AC + 0.81BC + 1.36BD + 0.9CD –
1.16A2 – 2.44B2 – 2.37C2 – 1.67D2 (2)
Sự ảnh hưởng của các yếu tố tuyến tính (A, B, C, D) đến giá trị hàm mục tiêu là lớn nhất, sau đó là ảnh hưởng của các yếu tố chập (AB, AC, AD, BC, BD, CD) và ảnh hưởng ít nhất đến giá trị hàm mục tiêu là các yếu tố bình phương (A2, B2, C2, D2).
Từ phương trình hồi quy (1) và (2) ta có thể thấy ngay ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin) và Y2 (hàm lượng carotenoid tổng), có các nhận xét sau”
- Ta thấy chỉ có 3 yếu tố B, C và D ảnh hưởng chính đến hàm Y1 và Y2. Yếu tố A thể hiện mức độ ảnh hưởng yếu hơn thông qua các tương tác chập và tương tác bình phương (AC, A2). 19.00 Dự đốn so với thực tế 34.00 30.25 26.50 22.75 D ự đoá n 19.60 23.11 26.62 30.13 33.64 Phần dư và phần hoạt động 3.00 1.50 0.00 -1.50 -3.00 Ph ần dư Thực tế 1 5 9 13 17 21 25 29 Phần hoạt động
Dự đoán so với thực tế Phần dư và phần hoạt động 36.00 30.00 24.00 18.00 3.00 D ự đoá n 1.50 0.00 -1.50 12.00 -3.00 1 5 9 13 17 21 25 29 Phần hoạt động 12.70 18.39 24.07 29.75 35.44 Thực tế Ph ần dư
- Trong đó mức độ ảnh hưởng của 3 yếu tố công nghệ theo thứ tự giảm dần B>D>C. Hai yếu tố B và D thì ảnh hưởng đồng biến (tương tác dương) với Y1 và Y2 còn yếu tố C ảnh hưởng nghịch biến (tương tác âm) với Y1 và Y2 tương ứng với các hệ số của chúng trong phương trình hồi quy (1).
Ảnh hưởng của các tương tác cặp yếu tố công nghệ đến các hàm mục tiêu được biểu thị thông qua các bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng biểu diễn 3D ở hình 4.2.7.
(b)
Hình 4.2.7. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hàm lượng carotenoid tổng (b)
Trên các bề mặt đáp ứng, vùng màu đỏ sẫm là vùng tối ưu. Tại đó, các giá trị hàm mục tiêu Y1, Y2 nằm trong vùng giá trị lớn nhất. Từ các bề mặt đáp ứng ở hình 4.2.7 có thể đưa ra nhận xét như sau:
Với các bề mặt đáp ứng biểu diễn hàm Y1, và Y2: 3 cặp yếu tố tương tác đôi (BC, BD, CD) ảnh hưởng lớn hơn 3 cặp yếu tố còn lại (AB, AC, AD). Trong 3 cặp yếu tố (BC, BD, CD) thì thứ tự ảnh hưởng mạnh đến hàm Y1 được sắp xếp lần lượt BD > BC > CD. Điều này hoàn phù hợp với kết quả thể hiện ở phương trình hồi quy (1) và (2).
4.2.7. Tối ưu hóa q trình chiết xuất
Q trình chiết xuất sinh khối cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng canthaxanthin) và Y2 (hàm lượng carotenoid tổng) đều đạt giá trị lớn nhất.
Để thực hiện điều này, tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 11.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Với các mục tiêu đặt ra là hàm lượng canthaxanthin và hàm lượng carotenoid tổng cáo nhất, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau:
+ Hàm lượng canthaxanthin Y1 (mức 4) + Hàm lượng carotenoid tổng Y2 (mức 3)
Kết quả tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 cho ta 1 giải pháp tương ứng với 1 bộ số liệu công nghệ. Bộ thơng số cơng nghệ tối ưu được trình bày ở bảng 4.2.4 Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.2.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1= 15.07 (mg/g) và Y2=18.26 (mg/g).
Mức độ đáp ứng theo hàm nguyện vọng được thể hiện ở hình 4.2.8. Theo đó với giải pháp này thì đạt được u cầu sau:
- Đối với 4 yếu tố ảnh hưởng đều đạt 100% nguyện vọng - Mục tiêu về hàm canthaxanthin đạt 97.81% nguyện vọng
- Mục tiêu về hàm lượng carotenoid tổng đạt 98.13% nguyện vọng - Nguyện vọng tổng thể đạt 97.94%.
Bảng 4.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến cơng nghệ
Biến mã hóa Biến thực
A B C D Nhiệt độ chiết siêu âm (0C) Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Thời gian chiết (phút) Công suất chiết siêu âm (W) 0.01 0.23 -0.02 0.27 35 9.5 90 145
Hình 4.2.8. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất
Hình 4.2.9. Điều kiện tối ưu các biến cơng nghệ và kết quả tối ưu hóa hàm mục tiêu Y1 và Y2
Kết quả trên được thực nghiệm lại với quá trình chiết canthaxanthin với quy mơ phịng thí nghiệm được trình bày ở hình sau:
Hình 4.2.10. Thực nghiệm chiết canthaxanthin ứng dụng điều kiện tối ưu hóa trong phịng thí nghiệm
Kết quả thực nghiệm thu được hàm lượng canthanxanthin: 14.9 ± 0.12 (mg/g) và hàm lượng tổng carotenoid: 18.1 ± 0.17 (mg/g) sau quá trình chiết siêu âm đạt xấp xỉ kết quả dự đốn của mơ hình. Sự khác biệt giữa điều kiện thực nghiệm và mơ hình có thể do sự khơng ổn định của các điều kiện chiết xuất.
4.2.8. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin
Kết quả từ 100g bột sinh khối khô ban đầu, trải qua các công đoạn chiết xuất và phân lập đã thu được 125mg canthaxanthin tinh sạch. Các dữ kiện hoá lý cho phép khẳng định hợp chất phân lập được chính là canthaxanthin có độ tinh sạch tới 98.5%.
Hình 4.2.11. Cơng thức hóa học của hợp chất canthaxanthin
Hợp chất này có các thơng số hóa lí sau: + Phổ khối ESI-MS: m/z = 565 [M+H]+ + Công thức phân tử: C40H52O2
+ Trạng thái: chất rắn màu đỏ + Điểm nóng chảy: 2112130C
+ Khả năng hồ tan: Không tan trong nước, tan tốt trong acetone, chloroform. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: được xác định trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Brucker 500 MHz tại viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.86 (2H, m, H-2,2’), 2.51 (2H, m, H-3,3’), 6.25 (2H, m, H-7,7’), 6.36 (2H, d, H-8,8’), 6.27 (2H, m, H-10,10’), 6.68 (2H, m, H-11,11’), 6.40 (2H, d, H-12,12’), 6.29 (2H, m, H-14,14’), 6.65 (2H, m, H-15,15’), 1.20 (6H, s, H-16,16’), 1.20 (6H, s, H-17,17’), 1.88 (6H, s, H-18,18’), 2.00 (6H, s, H-19,19’), 2.18 (6H, s, H-20,20’) 13C NMR: δ 198.7 (C=O), 160.9 (C-6,6’), 141.1 (C-8,8’), 139.3 (C-12,12’), 136.6 (C- 13,13’), 134.8 (C-9,9’), 134.3 (C-10,10’), 133.6 (C-14,14’), 130.5 (C-15,15’), 129.9 (C-5,5’), 124.7 (C-11,11’), 124.2 (C-7,7’), 160.9 (C-6,6’), 37.7 (C-2,2’), 35.7 (C-1,1’), 34.3 (C-3,3’), 27.7 (C-16,16’), 27.7 (C-17,17’), 13.7 (C-18,18’), 12.7 (C-20,20’), 12.5 (C-19,19’). Hình 4.2.12. Sắc ký đồ hợp chất canthaxanthin sạch Hình 4.2.13. Canthaxanthin sạch Hình 4.2.14. Sắc ký lớp mỏng canthaxanthin
Dựa vào sắc ký đồ HPLC ta có thể thấy, với điều kiện chạy máy (như ở mục phương pháp nghiên cứu) thì canthaxanthin xuất hiện ở thời gian lưu là Rt =12.27 phút. Dựa vào diện tích peak đã xác định được độ tinh sạch của sản phẩm đạt 98.5%.
4.3. Tổng hợp và ứng dụng liposome
4.3.1. Quá trình tổng hợp và các đặc điểm của liposome chứa canthaxanthin và α- tocopherol
Liposome được tạo ra bằng phương pháp hydrat hóa màng mỏng đã được thiết lập sau đó là ép đùn. Các đặc tính hóa lý của mẫu liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol và hệ thống liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol đã được nghiên cứu. Như thể hiện trong hình 4.3.1, kích thước trung bình của liposome đối chứng là 105.53 ± 9.02 (trung bình ± SD; n = 3) trong khi kích thước trung bình của liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol là 97.33 ± 4.64 và 103.80 ± 6.95 (trung bình ± SD; n = 3), tương ứng. Trong trường hợp liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol, kích thước trung bình của liposome có nồng độ canthaxanthin IC = 0.1%, IC = 0.5% và IC = 1% là 109.70 ± 6.36; 105.10 ± 8.41 và 109.20 ± 5.66 (trung bình ± SD; n = 3). Chỉ số polydispersity (PDI), một chỉ số về tính đồng nhất phân tán, của tất cả các liposome có cơng thức dao động từ 0 đến 0.2, cho thấy rằng các thành phần hoạt tính được phân tán đồng nhất trên các liposome. Giá trị PDI của liposome chứa α-tocopherol thấp nhất là 0.150 ± 0.044 (trung bình ± SD; n=3). Tất cả các liposome khác có giá trị PDI cao hơn nhưng vẫn thấp hơn 0.2. Khơng có sự khác biệt đáng kể về kích thước trung bình và PDI giữa liposome đối chứng và canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol.
Hình 4.3.1. Kích thước trung bình và giá trị PDI của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng canthaxanthin
và α-tocopherol ở các tỉ lệ IC = 0,1%; IC = 0,5% và IC = 1%. Kíc h thư ớc trung bình (mm ) Liposome lecithin Liposome canthaxanthin Liposome α-tocopherol Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=0.1% Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=0.5% Liposome canthaxanthin α-tocopherol IC=1% Kích thước trung bình Chỉ số đồng nhất phân tán
Hiệu suất quá trình đóng gói (EE%) và khối lượng tải thuốc (DL%) của liposome chứa canthaxanthin lần lượt là 59.6 ± 2.3% (trung bình ± SD; n = 3) và 2.39 ± 0.23% (trung bình ± SD; n = 3) (Bảng 4.3.1). Hiệu quả bao bọc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol giảm khi tăng nồng độ canthaxanthin trong lecithin liposome. Giá trị EE% của liposome chứa canthaxanthin tại IC = 0.1%, IC = 0.5% và IC = 1% lần lượt là 85.3 ± 2.1; 72.9 ± 1.8 và 55.3 ± 2.6.
Bảng 4.3.1. Giá trị EE và DL của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol liposome với các tỉ lệ IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1%. Các số là kết quả của các
phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Liposome EE (%) DL (%)
Liposome đối chứng - -
Liposomes chứa canthaxanthin 59.6 ± 2.3 2.39 ± 0.23
Liposome chứa α-tocopherol - -
Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 0.1% 85.3 ± 2.1 1.87 ± 0.35 Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 0.5% 72.9 ± 1.8 2.09 ± 0.13 Liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol IC = 1% 55.3 ± 2.6 2.23 ± 0.21 Vai trò của lớp lipid trong việc bảo vệ các vật liệu bên trong của liposome được nhấn mạnh bởi thực tế là các thành phần hoạt tính như carotenoid dễ dàng phân hủy trong mơi trường vi mơ có tính axit và do ảnh hưởng của các enzym. Q trình giải phóng invitro của canthaxanthin từ liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol với IC=0.1%; IC=0.5% và IC=1% trong PBS ở pH 7.4 được thể hiện trong hình 4.3.2. Trong vịng 4 giờ đầu tiên, sự giải phóng canthaxanthin từ các liposome mà khơng có α-tocopherol dường như nhanh hơn các liposome khác. Ngược lại, liposome chứa canthaxanthin ở IC=0.1% cho thấy tốc độ giải phóng chậm hơn, bền vững, đạt 0.46 sau 4 giờ. Ngoài ra, việc tăng nồng độ canthaxanthin được nạp vào dường như làm giải phóng canthaxanthin nhanh hơn trong vòng 1 giờ đầu tiên. Sau 4 giờ ủ, khoảng 68% canthaxanthin được giải phóng khỏi liposome chứa 1% canthaxanthin. Những dữ liệu này cho thấy rằng canthaxanthin có thể được bao bọc tốt trong liposome và được giải phóng trong một thời gian dài.
Hình 4.3.2. Thí nghiệm invitro giải phóng canthaxanthin từ liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol tại IC = 0.1%; IC =
0.5% và IC = 1% trong PBS ở pH 7.4 T ốc đ ộ gi ải phóng Liposome canthaxanthin Thời gian (h)
Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=1% Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=0.5% Liposome canthaxanthin và α- tocopherol IC=0.1%
Canthaxanthin + α-tocopherol (1/9; w/w) Hỗn hợp A Hỗn hợp B Hỗn hợp C Liposome thô Liposome thành phẩm Khuấy trộn đồng nhất 1. Bổ sung 2 ml CH2Cl2
2. Bổ sung lecithin 3. Khuấy trộn đồng nhất
Cô quay đuổi dung môi
1. Bổ sung 4 ml nước cất 2. Bóc màng
1. Đùn ép 50 lần qua màng kích thước lỗ 100 nm 2. Để lạnh 40C, 12 giờ
4.3.2. Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol
Hình 4.3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol
Thuyết minh quy trình
Canthaxanthin và α-tocopherol được đưa lên liposomes bằng phương pháp bay hơi màng mỏng như đã mô tả trước đây. Một cách ngắn gọn, hỗn hợp canthaxanthin và
α-tocopherol có tỷ lệ khối lượng cố định 1:9 (hỗn hợp A) được hòa tan trong 2 ml diclometan cùng với lecithin đậu nành. Các nồng độ ban đầu (IC=mcanthaxanthin/mlipid, % wt / wt) của canthaxanthin được chọn lần lượt là 0.1%, 0.5% và 1.0%. Sau khi hòa tan, màng mỏng thu được bằng cách loại bỏ dung môi hữu cơ trong nồi cách thủy ở 300C dưới áp suất bình 250 mbar và tốc độ quay cấp 2. Nước cất (4ml) được thêm vào để bóc màng, tạo thành liposome có chứa canthaxanthin. Để có được kích thước cố định, liposome được đưa qua màng polycác bonate 100 nm trong máy đùn mini 50 lần. Mẫu liposome thành phẩm cuối cùng được đựng trong eppendorf và giữ trong tủ lạnh 12 giờ ở 40C trong bóng tối. Tất cả các mẫu khác (liposome, liposome chứa canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol) được chuẩn bị với cùng một quy trình và tỷ lệ nguyên liệu tương ứng.
4.3.3. Sự tăng trưởng của cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin
Việc nuôi cá hồi vân được thực hiện vào mùa đông để đảm bảo các điều kiện sinh trưởng và nhiệt độ nước thích hợp. Oxy hịa tan trong thí nghiệm được kiểm sốt và dao động từ 7.1 đến 10.9 mg/l, với mức trung bình là 8.2mg/l [111; 112].
Ban đầu, trọng lượng của cá là 309.43±12.98 g trước khi được ni và khơng có sự khác biệt giữa các nhóm. Trọng lượng ướt trung bình của cá được ghi lại hàng tháng trong quá trình thử nghiệm cho ăn và một lần trước khi lọc. Trong q trình thí nghiệm, cá vẫn khỏe mạnh và tỷ lệ chết là 0%. Vào cuối thử nghiệm, cá được cho ăn với chế độ ăn có bổ sung 1g/kg canthaxanthin và liposome chứa α-tocopherol (IC=0.5%) cho thấy trọng lượng trung bình cao hơn đáng kể so với các nhóm đối chứng thí nghiệm khác (p<0.05) (hình 4.3.3).
Cá hồi vân được ni bằng chế độ ăn bổ sung canthaxanthin ở 20mg/kg (chế độ ăn IV) cho thấy trọng lượng ướt thấp hơn đáng kể (p <0.05) sau hai, ba và bốn tháng so với các nhóm khác. Phát hiện này phù hợp với báo cáo của Murphy và cộng sự khi tăng liều lượng canthaxanthin cho ăn dẫn đến tăng trọng lượng thấp hơn ở cá hồi vân [112]. Trọng lượng cuối cùng của cá ở các nhóm được cho ăn với khẩu phần bổ sung 1g/kg lecithin hoặc 100mg/kg α-tocopherol cao hơn, mặc dù khơng có ý nghĩa thống kê (p> 0.05), so với những con được nuôi bằng khẩu phần ăn công nghiệp thông thường. Trong trường hợp các nhóm được cho ăn với chế độ ăn bổ sung canthaxanthin và α-tocopherol trên liposome (Chế độ ăn VII, IX và X), mức tăng trọng của chúng cao hơn khi tăng nồng độ canthaxanthin từ 0.1% lên 0.5% nhưng gần như không tăng
Các kết quả hiện tại tương tự như các báo cáo trước đây chỉ ra rằng việc đưa các carotenoid như canthaxanthin hoặc astaxanthin vào thức ăn cho cá ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn của cá hồi nước ngọt hoặc cá vẹt [47]. Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng báo cáo rằng carotenoid có thể tăng cường sự tăng trưởng bằng cách hoạt động như hormone thụ tinh nhưng cho đến nay, chức năng sinh học của carotenoid trong cá vẫn chưa được xác nhận.
Hình 4.3.4. Sự thay đổi trọng lượng của các nhóm cá hồi vân được ni bằng các chế độ ăn khác nhau.
Bảng 4.3.2 cho thấy kết quả về thành phần cơ của cá hồi vân sau 3 tháng nuôi với các chế độ ăn khác nhau. Khơng có sự khác biệt đáng kể giữa 10 nhóm xử lý ở tất cả các chỉ tiêu (protein thô, lipid thô, tro và độ ẩm). Những phát hiện này không phù hợp với các báo cáo trước đây chứng minh rằng thiếu hụt canthaxanthin trong chế độ ăn uống có thể ảnh hưởng đến tiêu hóa và hấp thụ lipid. Cụ thể, người ta thấy rằng việc bổ sung carotenoid trong chế độ ăn uống đã ảnh hưởng đến q trình tiêu hóa và hấp thụ lipid ở chuột. Tương tự đối với thủy sản, Brizio ghi nhận rằng canthaxanthin ảnh hưởng đến q trình tiêu hóa lipid ở cá. Tuy nhiên, ảnh hưởng của canthaxanthin và α- tocopherol đối với thành phần cơ cá vẫn còn nhiều tranh cãi và phức tạp, và cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểu cơ chế của chúng.
Tr ọng lư ợng cá ư ớt ( kg) Th ời g ian cho cá ăn ( tháng )
Các chế độ nuôi cá hồi vân (CĐ: chế độ ăn)
Bảng 4.3.2. Thành phần của cơ cá hồi vân sau 3 tháng thí nghiệm (n=3, đơn vị: % khối lượng ướt)
Thí nghiệm Protein thơ Lipid
thơ Tro Độ ẩm
Chế độ I Khẩu phần thức ăn thương mại 20.19 ± 1.15 6.79 ± 1.10
1.83 ± 0.12
73.79 ± 1.73 Chế độ II Khẩu phần thức ăn thương mại bổ sung 1 g/kg
lecithin