8.3.1. Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme:
- Phản ứng do enzyme có thể khái quát đơn giản hóa bằng phương trình phản ứng: - Có thể xác định hoạt độ enzyme bằng cách phân tích sự biến đổi theo thời gian trong điều kiện phản ứng xác định của: cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành hoặc cả cơ chất và sản phẩm. Tùy theo đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp, yêu cầu về độ chính xác, điều kiện của phòng thí nghiệm… mà chọn cách xác định phù hợp nhất. Tuy nhiên, cách đáng tin cậy nhất trong mọi trường hợp là xác định sản phẩm tạo thành theo thời gian (vì có thể hoạt độ enzyme cần xác định rất thấp, sự chuyển hóa cơ chất khó đo được chính xác cho nên sự xuất hiện của sản phẩm có thể được xác định bằng những cách đo đặc hiệu cho phép khẳng định sự có mặt của enzyme một cách tin cậy).
8.3.2. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 8.3.2.1. Phân tích liên tục:
Là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên
tục theo thời gian. Tuy nhiên yêu cầu đối với thiết bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt đây là mặt hạn chế của phương pháp. Đồng thời, do phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó thực hiện phân tích hoạt độ nhiều mẫu enzyme cùng lúc.
8.3.2.2. Phân tích gián đoạn:
Là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian
nhất định thì ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Để ngừng phản ứng có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt enzyme: nhiệt độ cao, thay đổi pH, dùng chất tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp…Phương pháp này khắc phục những hạn chế của
định, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu…Tuy nhiên vấn đề đặt ra là phải tìm cách làm ngưng phản ứng thích hợp nhất.
Dựa theo nguyên tắc xác định hoạt độ trên, có thể xác định theo một hoặc một số phương pháp chính sau đây:
8.3.2.2.1. Phương pháp đo độ nhớt:
Dùng nhớt kế đo sự biến đổi độ nhớt của dung dịch phản ứng. Áp dụng với các enzyme mà cơ chất có độ nhớt cao hơn hẳn so với sản phẩm (chất có phân tử lớn như acid nucleic, protein, cellulose…).
8.3.2.2.2. Phương pháp phân cực kế:
Sử dụng khi cơ chất và sản phẩm có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực và có góc quay riêng khác nhau.
8.3.2.2.3. Phương pháp quang phổ kế:
Được sử dụng phổ biến hiện nay, dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng xác định của cơ chất, hoặc sản phẩm phản ứng.
8.3.2.2.4. Phương pháp hóa học:
Dùng các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành. Thông thường phải chọn phản ứng tạo nên các phức chất màu có độ hấp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó để từ đó định lượng hợp chất này.
Phương pháp định lượng cơ chất còn lại hay sản phẩmtạo thành có thể đơn giản là do cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành một cách trực tiếp. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, có thể đo 1 cách gián tiếp và do đó phép đo phức tạp hơn.
8.3.3. Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme:
- Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp. Với những enzyme lần đầu tiên nghiên cứu, nên chọn pH trung tính 300C - 370C. Sau đó có những điều chỉnh sau nếu cần thiết.
- Bên cạnh pH và nhiệt độ, cần lưu ý cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền.
- Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, nên phải dùng một loại đệm hay một hệ thống đệm thích hợp nào đó. Nồng độ đệm thường dùng là 20-50 nM. Tuy vậy các phản ứng sinh acid, base cần phải dùng đệm ở nồng độ cao hơn tránh thay đổi pH trong quá trình thí nghiệm. Cần chọn
loại đệm thích hợp tránh làm kết tủa các yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+.
- Cơ chất và sản phẩm, đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng. Nếu phân tích nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng phải duy trì như nhau.
- Luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai sót.
-Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp, tránh làm biến đổi cơ chất hay cơ chất hay sản phẩm cần đo hay can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm phản ứng enzyme (chất làm ngừng phản ứng có cùng bước sóng hấp thụ ánh sáng cần đo với chất phản ứng hay ức chế phản ứng tạo màu tiếp theo của phân tích.)
Tóm lại việc xác định hoạt độ của enzym chỉ cho số liệu tin cậy khi chọn được phương pháp thích hợp và có các bước tiến hành đúng.
Chương 9 AN TOÀN LAO ĐỘNG VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG