Có 3 thành phần chủ yếu trong hệ thống định l−ợng phóng xạ miễn dịch: - Kháng nguyên đánh dấụ
- Kháng thể (chất gắn đặc hiệu). - Hệ thống tách phần F và phần B.
2.1. Kháng nguyên đánh dấu (Tracer)
2.1.1. Kháng nguyên
Protein, glucoprotein, peptit có trọng l−ợng phân tử 3000 Dalton hay lớn hơn là những kháng nguyên tự nhiên và có tính gây miễn dịch (tạo kháng thể). Các steroid, các hormon giáp, prostaglandin và một số thuốc có trọng l−ợng phân tử nhỏ tuy có tính kháng nguyên nh−ng không có tính gây miễn dịch (kháng nguyên không hoàn toàn) và đ−ợc gọi là hapten. Để tạo đ−ợc kháng thể, các kháng nguyên này cần đ−ợc gắn với một prorotein thích hợp nh− albumin, globulin, polylysin hoặc các chất có trọng l−ợng phân tử caọ Trong thực tế protein th−ờng đ−ợc sử dụng để gắn với hapten là albumin huyết thanh bò.
Sơ đồ d−ới đây mô tả sự liên kết của hapten với protein để tạo thành phức hợp có tính kháng nguyên hoàn toàn.
+
Hapten + Albumin huyết thanh bò (Hapte - albumin) = kháng nguyên
2.1.2. Kháng nguyên đánh dấu phóng xạ
Các kháng nguyên đ−ợc đánh dấu phóng xạ dùng trong kỹ thuật RIA gọi là tracer. Kháng nguyên đánh dấu phải đặc biệt tinh khiết và có hoạt độ riêng cao vì các tính chất này sẽ quyết định độ đặc hiệu và độ nhạy của phép định l−ợng.
Các đồng vị phóng xạ (ĐVPX) thích hợp dùng để đánh dấu kháng nguyên cần có 3 đặc tính cơ bản sau đây:
- Có hoạt độ riêng tối thiểu đủ cao để đảm bảo độ nhạy của phản ứng. - Gắn t−ơng đối dễ dàng vào chất cần đánh dấụ
- Thời gian bán huỷ không quá ngắn hoặc không quá dàị
Các ĐVPX th−ờng đ−ợc sử dụng để đánh dấu là: 125I, 131I, 3H, 57Co, 32P, 35S. Trong thực tế 125I có thời gian bán rU t−ơng đối dài (60 ngày) nên thông dụng nhất. Các
[ ] [ 0] 0 0 / 1 / log ) / ( B B B B B B Logit e − =
ĐVPX có thể là các nguyên tố cấu trúc nên phân tử kháng nguyên, trong quá trình đánh dấu chúng có thể thay thế một nguyên tố đU có trong phân tử kháng nguyên hoặc gắn thêm vào trong cấu trúc của chúng.
Đối với các hormon đa peptit, cách đánh dấu chính là dùng 125I hoặc 131Ị Để tăng khả năng gắn iốt vào phân tử protein cần oxy hoá iốt với chất xúc tác là cloramin T để tạo I0 từ I - (vì chỉ có iốt tự do ở mức oxy hoá cao mới có khả năng gắn chặt với protein). Ph−ơng thức đánh dấu này cần phải đ−ợc tiến hành thận trọng để không làm thay đổi thuộc tính sinh học của hợp chất nhất là thuộc tính miễn dịch hay các thuộc tính sinh học đặc biệt khác.
Với các chất phi peptit, đánh dấu đồng vị phóng xạ vào cấu trúc phân tử bằng ph−ơng pháp sinh tổng hợp (Ví dụ: 3H - cortisol, 57Co - cyanocobalamin, 125I hoặc
131I - triodothyronin và thyroxin).
Trong quá trình bảo quản, các hợp chất đánh dấu th−ờng bị hai ảnh h−ởng sau: - Thay đổi cấu trúc do năng l−ợng bức xạ trong phân tử kháng nguyên, đặc biệt đối với các kháng nguyên có trọng l−ợng phân tử thấp.
- Các ĐVPX có thể tách khỏi hợp chất đánh dấu làm giảm hoạt độ phóng xạ của chúng và giải phóng các ĐVPX ở dạng tự do dẫn đến sai lệch kết quả chẩn đoán. Vì vậy cần kiểm tra độ tinh khiết hoá phóng xạ của các hợp chất đánh dấu tr−ớc khi sử dụng.
Theo lí thuyết để bảo quản các hợp chất đánh dấu phóng xạ chỉ cần pha loUng để tránh bức xạ ion hoá. Nh−ng điều này không thể áp dụng cho các hợp chất đánh dấu trong RIẠ Vì vậy ng−ời ta phải dùng các loại dung môi đặc biệt để bảo quản nhằm giảm hiệu ứng của bức xạ ion hoá. Nhiệt độ cũng rất quan trọng đối với độ bền vững của hợp chất đánh dấụ ở nhiệt độ cao, iốt phóng xạ dễ tách ra khỏi hợp chất đánh dấu, nhiệt độ thấp quá cũng dễ gây biến tính kháng nguyên và phá huỷ liên kết. Do vậy chỉ nên bảo quản ở nhiệt độ + 4 0C.
2.2. Kháng thể (chất gắn đặc hiệu)
Hầu hết các mô phát triển cao đều có thể nhận biết một “vật lạ” khi xâm nhập vào cơ thể nếu cấu trúc hoá học của chúng không giống cấu trúc các chất trong cơ thể. Một vật lạ nh− vậy đ−ợc gọi là kháng nguyên. Khi vào cơ thể kháng nguyên sẽ kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể. Kháng thể bản chất là protein (globulin miễn dịch), khi đó kết hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể.
2.2.1. Tạo kháng thể (kháng huyết thanh)
Để tạo kháng thể đặc hiệu, ng−ời ta th−ờng dùng kháng nguyên gây miễn dịch cho động vật. Súc vật thích hợp để gây miễn dịch là lợn biển, thỏ, chuột lang, khỉ và các động vật khác. Trên thực tế thỏ và lợn biển th−ờng đ−ợc dùng nhiều nhất. Những súc vật để gây miễn dịch chọn ở lứa tuổi trung bình. Giới tính của súc vật không có ý nghĩ trong việc tạo miễn dịch.
Có thể gây miễn dịch cho súc vật bằng cách tiêm kháng nguyên vào phúc mạc, cơ, trong da, d−ới da hoặc tĩnh mạch. Nhiều tác giả cho rằng mũi đầu tiên nên tiêm ở bàn chân, những mũi sau có thể tiêm ở các vị trí khác trên cơ thể.
Các kháng nguyên đ−a vào phải đảm bảo số l−ợng và chất l−ợng nhất là tính gây miễn dịch. L−ợng kháng nguyên để tạo miễn dịch trên súc vật phụ thuộc vào từng loại hormon và cá thể gây miễn dịch.
Sau khi tiêm kháng nguyên, kháng thể bắt đầu đ−ợc hình thành. Nồng độ kháng thể trong máu tăng dần và đạt mức cao nhất từ 10 đến 14 ngày sau mũi tiêm đầu tiên, và sau đó giảm dần. Để duy trì l−ợng kháng thể trong máu cần phải tiêm kháng
nguyên nhắc lại nhiều lần. Khoảng cách giữa các lần tiêm tuỳ thuộc vào mỗi loại kháng nguyên và tính đặc hiệu của chúng.
2.2.2. Các thuộc tính của kháng huyết thanh
Các kháng huyết thanh thu đ−ợc trong quá trình gây miễn dịch trên động vật cần phải đ−ợc kiểm tra về độ nhạy, độ đặc hiệu và xác định nồng độ phản ứng thích hợp cho phép định l−ợng.
Để có đ−ợc nồng độ thích hợp, kháng huyết thanh cần đ−ợc pha loUng cho đến khi gắn đ−ợc 50% kháng nguyên đánh dấu (B/F=1) khi có kháng nguyên không đánh dấụ Mức dộ pha loUng của kháng huyết thanh phụ thuộc vào hoạt độ riêng của kháng nguyên và độ đặc hiệu của kháng thể.
Độ nhạy của kháng huyết thanh đ−ợc xác định bằng khả năng phát hiện đ−ợc một l−ợng nhỏ nhất kháng nguyên cần định l−ợng.
Tính đặc hiệu của kháng huyết thanh đ−ợc xác định không chỉ là khả năng gắn của nó với kháng nguyên cần định l−ợng, mà còn phản ứng chéo với các kháng nguyên khác có cấu trúc t−ơng tự để tạo thành những liên kết không đặc hiệu làm giảm độ nhạy của nghiệm pháp. Chính vì vậy cần phải kiểm tra độ đặc hiệu và độ nhạy của kháng huyết thanh tr−ớc khi sử dụng.
2.2.3. Bảo quản kháng huyết thanh
Sau khi thu đ−ợc kháng huyết thanh thích hợp, việc bảo quản cũng rất cần phải quan tâm đến để chúng không bị thay đổi cho đến khi sử dụng. Ph−ơng pháp bảo quản thông th−ờng là làm đông khô, chia thành những l−ợng nhỏ và giữ ở nhiệt độ -23 0C. Tr−ớc khi dùng, cần để tan đá tự nhiên và sử dụng ngaỵ Một ph−ơng pháp khác là làm tủa gammaglobulin, sau đó làm sạch bằng thấm tích và đông khô. ở dạng này cũng có thể l−u giữ kháng thể đ−ợc nhiều năm mà không làm thay đổi tính chất của chúng.
2.3. Hệ thống tách phần tự do (F) và phần phức hợp (B)
Đây là một khâu quan trọng trong kỹ thuật định l−ợng miễn dịch phóng xạ. Có tách đ−ợc thì mới có thể đo hoạt độ phóng xạ của phần B, phần F để lập các tỷ số và xây dựng đồ thị chuẩn. Có một số kỹ thuật tách nh− sau:
- Ph−ơng pháp tách phần F ra khỏi phần B: bằng các kỹ thuật nh− sắc ký, điện di trên gel, điện di trên giấy, trao đổi ion, thẩm tích, lọc...
- Ph−ơng pháp hấp phụ pha rắn thành phần F: bằng các chất hấp phụ nh− nhựa Amberlit, than hoạt, Silicat, Dextran, Florisil, bột Sellulose, Sephadex ...
- Ph−ơng pháp hấp phụ pha rắn thành phần B bằng các kỹ thuật:
+ Kết tủa hoá học (Chemical precipitation): dùng dung môi hữu cơ nh− polyethylenglucol (PEG) hoặc các muối (NH4)2SO4, Na2SO4...
+ Kết tủa miễn dịch phóng xạ (Immunological precipitation): dùng kháng thể thứ hai (kỹ thuật Sandwich). Kháng thể thứ nhất đ−ợc hấp phụ hoặc gắn bằng hoá học lên bề mặt của giá đỡ rắn (thành ống nghiệm hay các hạt nhựa), kháng thể thứ hai ở dạng tự do và đ−ợc đánh dấu phóng xạ. Kháng nguyên cần định l−ợng sẽ liên kết với cả hai kháng thể nàỵ Ph−ơng pháp này th−ờng đ−ợc sử dụng trong kỹ thuật định l−ợng đo phóng xạ miễn dịch (IRMA).