Hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta ựã xác ựịnh ựược các chỉ thị phân tử liên quan ựến nhiều tắnh trạng quan trọng ở cây lúa mà ựặc biệt là các chỉ thị liên quan ựến tắnh kháng bệnh. đối với bệnh bạc lá, xác ựịnh 7 gen kháng bệnh bạc lá và ựánh dấu bằng phương pháp RFLP (Phan Hữu Tôn tổng hợp, 2001). Kết quả tổng hợp ở bảng 2.2.
Bảng 2.1. Bản ựồ liên kết di truyền giữa gen quy ựịnh tắnh trạng nông sinh học quan trọng với RFLP ựánh dấu
Gen Tắnh trạng Nguồn cho NST RFLP và ựộ
liên kết
Tài liệu tham khảo Xa1 Chống bạc lá Kogyoku 4 Npb235 3.3cM Npb197 7.2 cM Yoshimura et al. 1992 Xa2 Chống bạc lá Tetep 4 Npb235 3.4cM Npb197 9.4 cM Yoshimura et al. 1992 Xa3 Chống bạc lá Chugoku45 11 Npb181 2.3cM Npb78 3.5cM Yoshimura et al. 1992 Xa4 Chống bạc lá IR20 11 Npb181 1.7cM Npb78 1.7cM Yoshimura et al. 1992 xa5 Chống bạc lá IR1545-339 5 RG556 0-1cM McCouch et al.1991 Xa13 Chống bạc lá Long grain 8 RZ28 5.1cM Zhang et al. 1994 Xa21 Chống bạc lá O.Longistaminata 11 pTA818,pTA248 0-1 cM RG103 Ronald et al. 1992
2.3.4. Kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh
2.3.4.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo ngoài cơ thể các ựoạn DNA với tốc ựộ nhanh chưa từng thấy và ựộ chắnh xác gần như tuyệt ựối ựược thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR).
Kỹ thuật PCR ựược Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục ựược hoàn thiện, phát triển sau khi sản xuất thành công Enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Themus aquaticus và thiết kế các máy chu trình nhiệt cho phép thay ựổi nhanh chóng, chắnh xác nhiệt ựộ cho từng chu kỳ phản ứng. Cho ựến nay kỹ thuật PCR ựược xem là một phương pháp nền quan trọng nhất của CNSH hiện ựại.
để nhân bất kỳ một ựoạn DNA nào nếu biết trước trình tự sắp xếp các nucleotid của nó, thì việc ựầu tiên là phải chọn một ựoạn ựặc hiệu trên mẫu ựó rồi thiết kế và tổng hợp hai ựoạn mồi (thường dài 20 - 30 nucleotid) ựối xứng với các bazơ ở ựầu 5Ỗ và ựầu 3Ỗ của ựoạn DNA ựịnh nhân. Dùng máy PCR ựể nhân ựoạn ựó lên. Sản phẩm PCR này ựưa lên ựiện di trên gel Agarose có thể trực tiếp phát hiện sự sai khác giữa gen trội hoặc lặn của tắnh trạng. Trường hợp không trực tiếp phát hiện sự sai khác này thì người ta tiếp tục cắt sản phẩm nhân PCR bằng một hoặc một vài Enzym cắt hạn chế thắch hợp sẽ tạo ra sự ựa hình (vắ dụ ựối với gen kháng bệnh bạc lá xa5).
2.3.4.2. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống kháng bệnh
Người ta ựã thiết lập ựược bản ựồ chi tiết về các chỉ thị DNA liên kết với nhiều gen quy ựịnh tắnh trạng nông sinh học khác nhau. Trên cơ sở ựó tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này, bằng cách tìm sự có mặt của một ựoạn DNA ựánh dấu liên kết chặt với gen ựó chứ không phải dựa vào kiểu hình. Từ ựó giúp các nhà chọn giống phân biệt ựược sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể có quan hệ họ hàng gần nhau, tăng ựược hiệu quả và ựộ chắnh xác của chọn lọc mà ựặc biệt là những tắnh trạng ựược quy ựịnh bởi gen lặn.
Cũng nhờ có kỹ thuật PCR, người ta có thể xác ựịnh và phân biệt nhanh các chủng vi khuẩn. Năm 2000, Adachi và T.Oku ựề xuất hai ựoạn mồi XOR-F
và XOR-R ựể nhân ựoạn DNA nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16s và 23s của Riboxom vi khuẩn bạc lá. Bằng cách này xác ựịnh nhanh và chắnh xác vi khuẩn gây bệnh bạc lá mà không cần dựa vào quan sát biểu hiện của khuẩn lạc và lây nhiễm nhân tạo.
Năm 2000, cùng với sự hợp tác của các chuyên gia Nhật Bản trong dự án Jica, nhóm nghiên cứu về bệnh bạc lá của trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội do Phan Hữu Tôn làm chủ nhiệm ựã tiến hành nghiên cứu khả năng kháng bệnh của các dòng chỉ thị nhằm tìm kiếm các gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở miền Bắc Việt Nam (Nguyễn Thị Lang và cộng sự, 2002). Trong số các gen kháng bệnh bạc lá lúa thường có mặt trong các giống lúa ựịa phương của Việt Nam: Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa13, Xa14, Xa21 thì các gen kháng Xa4,
xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo giống lúa
kháng bệnh bởi chúng có khả năng kháng ựược hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở miền Bắc Việt Nam (Bùi Trọng Thủy và Phan Hữu Tôn, 2004).
Tại trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội, Phan Hữu Tôn và cộng sự ựã tiến hành việc tìm kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa ựịa phương bằng kỹ thuật PCR kết hợp với lây nhiễm nhân tạo. Năm 2000, trên cơ sở ựiều tra 145 giống lúa ựịa phương, phát hiện ựược 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen
Xa7. Năm 2004, tiếp tục ựiều tra 120 giống lúa ựịa phương ựã phát hiện ựược
thêm 8 giống chứa gen xa5. Năm 2005, ựiều tra trên 500 giống lúa ựịa phương và thu ựược 56 giống chứa gen Xa4, 36 giống chứa gen xa5, 16 giống chứa gen Xa7 (Phan Hữu Tôn, 2005).
Năm 2010, Lã Vĩnh Hoa và cộng sự ựã ứng dụng chỉ thị phân tử DNA ựiều tra 150 mẫu giống lúa ựịa phương thu thập ở miền Bắc, ựã phát hiện ựược 51 mẫu giống chứa gen Xa4, 13 mẫu giống chứa gen Xa7, 2 mẫu giống chứa gen xa5, 2 mẫu giống chứa gen Xa4 và Xa7, 2 mẫu giống chứa gen Xa7 và xa5. Năm 2011, Vũ Hồng Quảng và cộng sự ựã sử dụng chỉ thị phân tử pAT248 và RM5509 ựể phát hiện ra các gen Xa7, Xa21 trên 3 dòng bố 9311BB, D42BB, R308BB. Kết quả cho thấy dòng R308BB có 90% cá thể chứa gen kháng Xa21 dạng đHT, 10% DHT; dòng bố D42BB có 10% số cá
thể DHT về gen Xa21; dòng bố 9011BB thì 100% cá thể chứa gen Xa7 và tất cả ựều ở dạng đHT. đây là nguồn vật liệu phong phú trong các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá, năng suất cao.