Bất kỳ ựoạn DNA nào ựược sử dụng ựể phân biệt sự khác nhau về kiểu hình (tắnh trạng) giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài ựều ựược gọi là chỉ thị phân tử DNA ựánh dấu gen (Phan Hữu Tôn, 2005). Hiện nay chỉ thị phân tử DNA ựược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống.
Chỉ thị DNA ựánh dấu gen gồm 9 phương pháp, sắp xếp theo thứ tự thường ựược sử dụng:
* Chỉ thị RFLP (sự ựa hình chiều dài các ựoạn cắt giới hạn, lai DNA/DNA). Phương pháp lai DNA là một kỹ thuật nhằm gắn kết với chọn lọc những mẫu ựặc thù của sợi DNA ựơn hoặc RNA dựa trên cơ sở ghép cặp bổ sung những ựoạn DNA sợi ựơn tương ứng ựã ựược chuyển dắnh vào màng lọc Nitrocellulose hoặc màng Nilon. để tiến hành phương pháp này, trước hết DNA của bộ genom ựược tách chiết, sau ựó tiến hành cắt bằng một hoặc vài emzym cắt hạn chế, ựể tạo ra các ựoạn DNA khác nhau, những mẫu này ựược phân tách trên gel Agarose. Tuỳ theo các ựoạn DNA dài, ngắn khác nhau mà sự di chuyển trên gel là khác nhau. Sau ựó người ta chuyển các vạch DNA lên màng Nitrocellulse hoặc màng Nilon và dắnh chặt vào ựó, như vậy ở gel có bao nhiêu vạch DNA thì trên màng có bấy nhiêu vạch. Màng lai ựược lai với các mẫu dò mục tiêu, ựã ựược ựánh dấu phóng xạ. Màng sau khi lai ựược rửa và chụp hình trên phim X-quang.
Chỉ thị RFLP thường ựược sử dụng ựể nghiên cứu ựộ phong phú về di truyền, sự phân hoá trong di truyền huyết thống (phylgenetics), lập bản ựồ gen.
Hiện nay, người ta ựã lập ựược bản ựồ di truyền liên kết rất chặt giữa các chỉ thị phân tử RFLP với nhiều gen quy ựịnh các tắnh trạng nông sinh học quan trọng, tạo cơ sở di truyền cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử ựánh dấu gen trong chọn lọc gián tiếp.
* Chỉ thị ALP (Amplicon Length Polymorphism): ựa hình về chiều dài những ựoạn DNA ựược nhân lên trên cơ sở nhân gen PCR. Sự ựa hình ựược phát hiện ngay bằng cách ựiện di sản phẩm nhân gen PCR trên gel Agarose hoặc Acrylamide.
* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): phương pháp AFLP ựược Zabeau và Vos cùng CS ựề xuất vào năm 1993-1995. Bản chất của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật PCR ựể nhân bản các ựoạn DNA ựã ựược cắt bởi emzym cắt giới hạn. Phương pháp này ựược tiến hành trên cơ sở ựầu tiên người ta dùng Enzym cắt hạn chế ựể cắt DNA genom, sau ựó ựắnh ựoạn DNA adapter tương ứng với từng Enzym một, rồi thiết kế ựoạn mồi trên cơ sở các adapter có bổ sung thêm 1-2 nucleotid ngẫu nhiên gắn vào ựầu 3Ỗcủa adapter, dùng kỹ nghệ PCR ựể nhân các ựoạn DNA ựược cắt lên sẽ tạo ra sự ựa hình phong phú. Chỉ thị AFLP là một kĩ thuật hữu ắch trong nghiên cứu di truyền và chọn giống, ựược ứng dụng ựể nghiên cứu ựa dạng di truyền và lập bản ựồ liên kết.
* Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): phương pháp này ựược William, Wegsh McClelland ựề xuất năm 1990. Phương pháp RAPD - Sự ựa hình các ựoạn DNA ựược nhân lên ngẫu nhiên trên cơ sở phương pháp PCR nhưng chỉ dùng một ựoạn mồi. Chỉ thị RAPD cho phép ựánh giá ựược tắnh ựa hình của DNA các mẫu nghiên cứu, xem xét ựược sự ựồng dạng và sai khác về mặt di truyền của các ựối tượng nghiên cứu.
* Chỉ thị DAF (DNA Amplification Fingerprinting): phương pháp nhân DNA in vân tay, dùng rất nhiều ựoạn mồi ựơn ngắn. Sử dụng chỉ thị DAF ựể xây dựng bản ựồ liên kết, phân lập các kiểu gen, xác ựịnh quan hệ họ hàng của sinh vật, nghiên cứu ựa hình của các ựoạn lặp lại ựơn giản trong genom, tìm chọn các dòng bất dục, duy trì phục hồi TGMS và PGMS trong nghiên cứu và sản xuất
lúa lai, xác ựịnh ựa dạng di truyền giữa hai bố, mẹ trên cơ sở ựó dự ựoán ựược ưu thế lai, xác ựịnh các gen số lượng, các gen chủ ựạo tạo ra ưu thế lai và dự ựoán khả năng phối hợp.
* Chỉ thị SSR (Single Sequence Repeats): phương pháp nhân hoặc lai những ựoạn DNA lặp lại trong genom ựể tìm sự ựa hình. Cho ựến nay chỉ thị này ựang ựược sử dụng rộng rãi hơn trong lĩnh vực di truyền phân tử của nhiều ựối tượng khác nhau như ựánh dấu gen, xác ựịnh giống, chuẩn ựoán bệnh di truyền.
*Chỉ thị AP-PCR (Arbitrary Primer Ờ PCR) : phương pháp dùng hai ựoạn mồi tùy hứng ựể nhân gen DNA bằng PCR nhằm xác ựịnh sự ựa hình của các kiểu gen.
* Chỉ thị SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism): ựa hình về cấu trúc sợi ựơn DNA tại ựó mở xoắn tạo thành hai sợi ựơn. Những nơi mở xoắn này ựược sử dụng ựể nghiên cứu sự ựa dạng của genome sinh vật .
* Chỉ thị MRDHV-DNA (Moderately Repeat, Dispersed DNA Highly Variable DNA ): phương pháp dùng kỹ nghệ DNA ựể nghiên cứu sự ựa dạng của những ựoạn DNA ngẫu nhiên, mẫu vệ tinh nhỏ dễ biến ựộng , phân tán và lặp ựi lặp lại trong bộ genome của sinh vật.
Việc áp dụng DNA trong ựánh dấu gen cho phép tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất ựịnh nào ựó trong quần thể phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một mẫu DNA ựánh dấu nào ựó liên kết chặt với gen ựó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó. Chắnh vì thế mà có thể ựánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kỳ giai ựoạn sinh trưởng nào, trong bất kỳ môi trường hay ựiều kiện môi trường ựánh giá nào, cùng một lúc ựánh giá ựược nhiều tắnh trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật. Dùng phương pháp chọn lọc DNA ựánh dấu gen có thể loại trừ ựược ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sự biểu hiện của các tắnh trạng. Áp dụng phương pháp này có thể tăng hiệu quả và ựộ chắnh xác trong
chọn lọc, ựặc biệt ựối với những tắnh trạng khó biểu hiện ra kiểu hình. Vì tắnh ựa hình của các DNA rất cao, nên ựã tạo khả năng cho các nhà chọn giống phân biệt ựược sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chắ khác nhau chỉ do ựột biến nhỏ hoặc cây tái tổ hợp, phân biệt ựược các alen các chủng sinh lý gây bệnhẦ