.ăXácăđ nhăcácăđ c tính probiotic ca ch ng ti măn ng

2.2 .ăPh ngăphápănghiênă cu

2.2.4 .ăXácăđ nhăcácăđ c tính probiotic ca ch ng ti măn ng

T b s uăt p ch ng ti măn ngăcóăkh n ngă c ch hai lo i VSV ch th E. coli và S. typhimurium, ti năhànhăđánhăgiáăcácăđ căđi m c a ch ng ti măn ngănh măh ng đ n phát tri n ch ph m probiotics. Các ch tiêuăđánhăgiáăbao g m:ăđ an toàn; kh n ngăkhángăaxităvàămu i m t; kh n ngăbámădínhătrênămơăhìnhăt bào ru t; kh n ngă c ch s bám dính c a ch ng vi khu n ch th trên mơ hình t bào ru tăvàăđánhăgiáă tính nh y c m v i kháng sinh c a các ch ng vi khu n ti măn ngănày.

2.2.4.1.ă ánhăgiáăđ an toàn

an toàn c a ch ng VSV ti măn ngăđ căđánhăgiáăthôngăquaăth nghi m kh n ngăphânăgi i máu. Các ch ng ti măn ngăđ c nuôi c y trong mơi tr ng MRS quaăđêmă 37oC.ăSauăđó,ăti n hành c y ria d ch nuôi c yălênămôiătr ng th ch máu c u. N u k t qu d ngătính,ăcácăvùngăxungăquanhăch ng vi khu n s xu t hi n các vòng tán huy tăvàăđánhăgiáălo i tán huy t.

2.2.4.2.ă ánhăgiáăkh n ngăkhángăaxităvƠ mu i m t

Ti n hành sàng l c ch ng vi khu n ti măn ngăcóăkh n ngăkhángăl iăđi u ki n axit trong d dày. 100 L ch ng vi khu năđ c ni c yătrongă5ămLămơiătr ng MRS có b sungăHClă1Măđ đi u chnhăpHămôiătr ng v n ngăđ 4,0.ăSauăđóă vi khu n 37oC trong vịng 4 gi và ti n hành tr iăđ aătrênămôiătr ng MRS đ đánhăgiáăm t đ vi khu nătr c và sau khi x lý. óiăch ng là ch ng vi khu năđ c nuôi trong môi tr ng MRS không ch nh pH (pH 6.5 ± 0.2)

Ti n hành sàng l c ch ng có kh n ngăkhángămu i m tăđ c b sung trong môiătr ng MRS n ngăđ 0,3% (w/v) mu i m t. Ti n hành trong 3 gi 37oC, sauăđóădch vi khu n s đ c tr iătrênămôiătr ngăMRSăđ xácăđnh m tăđ VSV trong các nghi m th c.ă i ch ng là ch ngăđ cănuôiătrongămôiătr ng MRS không b sung mu i m t.

2.2.4.3.ă ánhăgiáăkh n ngăbámădínhătrênămơăhìnhăt bào ru t

T bào ru t Caco-2ăđ c nuôi c yătrongămôiătr ng RPMI b sung 10% FBS (fetal bovine serum ậ huy t thanh bào thai bò), 1% kháng sinh Streptomycin ậ penicillin đi u ki n 37oC, 5% CO2.ă chu n b cho thí nghi măđánhăgiáăkh n ngă bám dính, t bào Caco-2ăđ c chu n b trênăđ aă24 gi ng (m tăđ 2x105 t bào/gi ng) trongăđi u ki nănh ătrênătrongă48ăgi ,ăđ n khi t bào Caco-2 m c thành l păđ năt bào trên b m t nuôi c y.

Ch ng vi khu n ti măn ngăsauăkhiăt ngăsinhăquaăđêmătrongămôiătr ng MRS, đ c pha lỗng v iămơiătr ng RPMI (không b sung FBS và kháng sinh) n ngăđ 108 CFU/ml. C y d ch huy n phù vi khu n các n ngăđ vàoăđ aăt bàoăđãăchu n b s n, đ aătrongă2ăgi , 37oC, 5% CO2. Sauăđó,ălo i b môiătr ngătrongăđ a,ăr a t bào v i dung d ch PBS 1X (phosphat buffered saline) (l p l iăb c r a 3 l n). Thêm 0.2 mL trypsin vào m i gi ng và đ aătrongă5ăphútă 37°C. Các t bào tách r iăđ c hút nhi u l n nh nhàngăđ t o huy năphùăđ ng nh t.ăSauăđó,ăhuy n phù t bàoăđ c pha lỗng b ngămơiătr ng MRS l ng và tr iătrênăđ aăth ch MRS, đ aătrongă24ăgi 37°C,ăvàăđ m các khu n l cătrênăđ aăth ch (B1 CFU/mL). T bào vi khu năbanăđ u đ c thêm vào m i gi ngăc ngăđ căđ m (B0 CFU/mL). T l bám dính c a vi khu n lên t bào Caco-2ăđ căxácăđ nh theo công th c [54]:

%ăđ bám dính = (B1 / B0) x 100

2.2.4.4.ă ánhăgiáăkh n ngă c ch s bám dính c a E. coli lên t bào ru t c a ch ng ti măn ngă

T bào Caco-2ăđ c chu n b nh ăm c 2.4.3. Ch ng VSV ti măn ngăđ c thêm vào gi ng t bào Caco-2 n ngăđ 106 CFU/ml v i 3 nhóm nghi m th c: nhóm (i) là nuôi c yăđ ng th i 02 lo i vi khu n (probiotic và E. coli) trong 2 gi (c nh tranh); nhóm (ii) là Caco-2ă tr c v i E. coli trong 2 gi ,ă sauă đóă Caco-2 v i probiotic trong 2 gi (thay th ); nhóm (iii) là x lí Caco-2 v i probiotic trong 2 gi tr c khi v i E. coli trong 2 gi ( c ch ).ă i ch ng âm là t bào Caco-2 x lí v i E. coli trong 2 gi , khơng x lí probiotic. Sau khi x lí, t bào Caco-2ăđ c r a v i PBSă1Xăvàăđ c tách b ng dung d ch trypsină1X.ăSauăđó,ăd ch huy năphùăđ c c y

tr i trênăđ aăth ch LB, 37oC trong 24 gi . S l ng khu n l c E. coli trênăđ aăth ch LBăđ c đ m và tính t l E. coli bám dính trên t bào theo công th c:

T l % bám dính E. coli trên t bào = (s khu n l c E. coli c a nghi m th c x lí v i ch ng ti măn ng)/ (s khu n l c c aăđ i ch ng âm).

2.2.4.5.ă ánhăgiáătínhănh y c m v i kháng sinh c a ch ng ti măn ng

Tính nh y c m v i kháng sinh c a vi khu năđ căxácăđ nh b ngăph ngăphápă khu chătánăđ a gi y kháng sinh [55]. Các ch ng vi khu n ti măn ngăđ c nuôi qua t ngăsinhăquaăđêmătrongămơiătr ng MRS l ng, 37oC. Sauăđó, hút 100 mL d ch vi khu n (pha lỗng v iămơiătr ng MRS v m tăđ 108 CFU/mL) tr iăđ u trên b m t môiă tr ng th chă MRS.ă aă gi y kháng sinh, đ ng kính 5mm (hãng BioLab, Hungary) đ căđ t lên m t th ch và 37oC trong 24 gi .

Các lo iăkhángăsinhăđ c th nghi m là ampicillin (10g), cefazolin (30g), imipenem (10g) ciprofloxacin (5g), gentamicin (10g), cefotaxime (10g). Tính nh y c m v iăkhángăsinhăđ căđánhăgiáăd aătrênăđ ng kính vịng vơ khu n (mm) [56]: ch ngă khángă khángă sinhă ( KVVKă ≤ 14 mm); kháng trung gian (14mm < KVVK≤ 19mm) ho c nh y c m ( KVVK ≥ 20 mm).