2.2 .ăPh ngăphápănghiênă cu
2.2.5 nh danh các ch ng ti măn ng
Các ng viên ti măn ngăt th nghi m tuy n ch n các ch ng có kh n ngă c ch hai ch ng ch th thôngăquaăph ngăphápăđ aăth ch hai l păđ căđ nh danh b ng ph ngă pháp gi i trình t vùng 16S rRNA v i c p m iă đ c hi uă LPW57ă (5’- AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)ăvàăLPW205ă(5’-CTTGTTACGACTTCACCC-3’)ă [57] đ xácăđ nhăđ n tên loài. K t qu gi i trình t vùngă16SărRNAăđ căđ i chi u v i ngân hàng gen NCBI b ng ph n m m BLAST nucleotide.
2.2.6.ă ánhăgiáăm căđ đápă ng mi n d ch c a t bào ru tăđ i v i ch ng vi sinh v t ti măn ng
Ki m tra m căđ đápă ng mi n d ch c a t bàoăđ i v i ch ng VSV ti măn ngă b ng cách xácăđnh m căđ bi u hi n các gen ti n viêm (TNF-a, IL-6, IL-8) c a t bào Caco-2 kích viêm b i LPS b ngăph ngăphápăReal-time PCR [48, 58].
Ch ng vi khu n ti măn ngăsauăkhiăt ngăsinhăquaăđêmătrongămôiătr ng MRS nhi tăđ 37oC,ăđ c pha loãng v iămôiătr ng RPMI không b sung huy t thanh bào thai bò (FBS) và kháng sinh n ngăđ 108 cfu/ml.
T bào Caco-2ăđ c c y trênăđ aă24 gi ng m tăđ 2x105 t bào/gi ng trong môiătr ng RPMI b sung 10% FBS. đ aăt bào trong 24 gi 37oC, 5%CO2. Sau đó,ăthêmăvàoăcácăgi ng t bào Caco-2 các nghi m th cănh ăsau:ă(1)ă i ch ng âm là t bào ch b sungămôiătr ngăRPMI;ă(2)ă i ch ng LPS (n ngăđ 1 g/ml) không b sung vi khu n;ă(3)ă i ch ng ch b sung vi khu n (108 cfu/ml); (4) B sungăđ ng th i vi khu n và LPS. Ti p t c đ aăt bàoăđãăx lí trong t 37oC, 5%CO2. Sau 24 gi x lí, lo i b d ch n iătrongămơiătr ng nuôi c y, r a gi ng v i dung d chăPBSăđ lo i b mơiătr ngăcịnăd .ăPh n t bàoăbámătrênăđ aăđ c tách chi tăđ thu RNA t ng s c a t bào.
u tiên, b sung 500 l dung d ch Trizol vào m i gi ng, đ aă đi u ki n nhi tăđ th ng trong 20 phút. Lúc này t bào đãăđ c ly gi i, hút ph n d ch trong gi ng sang eppendorf 1.5ml. Ti p t c b sung 100 l chloroform vào ng, vortex m u 15s, nhi tăđ phịngătrongă3ăphút.ăSauăđó,ălyătâmă ng 12.000 x g trong 15 phút, 4oC. Sau khi ly tâm, dung d ch trong ng tách thành hai l p, l păd i là pha c a phenol ậ chloroform; l pătrênălàăphaăn c, RNA n m trong pha này. Hút nh nhàng ph n d ch l p trên sang eppendorf m i. Ti n hành t a RNA trong d ch này v i 250
l isopropanol, m u nhi tăđ th ngătrongă10ăphút,ăsauăđóăly tâm m u 12.000
x g trong 10 phút, 4oC. Hút b hoàn toàn d ch n i trong ng, lúc này RNA t a đáyă ng. R a eppendorf v i 500 l ethanol 75%, l c nh eppdendorfătr c khi ly tâm 12.000xg trong 10 phút, 4oC,ăsauăđóăhútăb ethanol; l p l i 2 l năb c r a ethanolăđ lo i s chăisopropanolăcònăd .ăS d ng quang ph k viăđ nhăl ngăđ đoăn ngăđ RNA trong m u tách chi tăđ c b căsóngăODă260ănmăvàăODă280ănmătr c khi t ng h p cDNA (complementary DNA).
Các m u RNA sau tách chi t s đ c t ng h p thành cDNA b ng kit RevertAidăFirstăStrandăcDNAăSynthesisăK1622ă(Thermo)ătheoăh ng d n c a nhà sãn xu t.ăSauăđó,ăm i m u cDNA s đ căđ nhăl ng m căđ bi u hi n các gen ti n
viêm b ngăph ngăphápăRealătimeă- PCR v i ch t nhu m hu nh quang SYBR green. Các c p m iăđ c hi u cho gen ti n viêm theo B ng 2.2 [59, 60]:
B ng 2.2. Trình t m iăđ c hi u trong ph n ng Real time PCR
Gen M i xuôi M iăng c
TNF-a 5’-TCTCGAACCCCGAGTGACAA-3’ 5’-TATCTCTCAGCTCCACGCCA-3’
IL-8 5’-TGGCTCTCTTGGCAGCCTTC-3’ 5’-TGCACCCAGTTTTCCTTGGG-3’
IL-6 5’-CACTCACCTCTTCAGAACGA-3’ 5’-CTGTTCTGGAGGTACTCTAGG-3’
GAPDH 5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ 5’-TCAGCCTTGACGGTGCCATG-3’
M căđ bi u hi n các mRNA t giá tr CT c a ph n ng real-timeăPCRăđ c tính theo cơng th c 2-CT [61]:
V i CT = (CT.target ậ CT.GAPDH)treat ậ (CT.target ậ CT.GAPDH)untreat
2.2.7. Phân tích x lý th ng kê
Phân tích th ngăkêăđ c th c hi n b ng ph n m m GraphPad Prism v.8.4.2. D li uăđ c phân tíchătheoăph ngăphápăphânătíchăph ngăsaiă(ANOVA)ăvàăđ c hi n th d i d ng k t qu trungăbìnhă(mean)ăvàăđ l ch chu n (SD). So sánh s khác bi t gi a các nhóm theoăph ngăphápăDunnett’sămultipleăcomparisions.
CH NGă3.ăK T QU VÀ TH O LU N 3.1. K t qu phân l p các ch ng VSV t các ngu n m u khác nhau