CH NGă3 .ăK T QU VÀ THO L UN
3.4.5 ánhăgiáătínhănh yc m vi kháng sinh ca ch ng ti măn ng
Vi căđánhăgiáătínhănh y c m v i kháng sinh là m t trong nh ng tiêu chí chính đ đánhăgiáăcácăch ng probiotic ti măn ng.ăCácăch ng vi khu năđ căđánhăgiáăb ng ph ngăphápăkhu chătánăđ aăgi y kháng sinh, k t qu thuăđ c B ng 3.4.
B ng 3.4. Tính nh y c m v i kháng sinh c a các ch ng ti măn ng Kháng sinh Hàm l ng (g) Các ch ng vi khu n 12 18 22 23 27 AMP 10 S S S S S CZ 30 R R R R R IPM 10 R S S S S Ci 5 R R R R R GE 10 S S S S S CT 10 I S S I S
Chú thích: AMP: ampicillin; CZ: cefazolin; IPM: imipenem; Ci: ciprofloxacin; GE: gentamicin; CT: cefotaxime, R: kháng kháng sinh; I: kháng trung gian; S: nh y c m.
Các ch ng VSV đ căcoiălàăprobioticăkhơngăđ căđóngăvaiătrịălàă ch a gen kháng thu căkhángăsinh,ăđi uănàyăđ c lo ng i r ng gen kháng thu c có th chuy n sang các vi khu n gây b nhăđ ng ru t [75]. K t qu kh o sát cho th y t t c 05 ch ng trong nghiên c uă nàyă đ th hi n nh y c m v i ampicillin, gentamicin và cefotaxime. Bên c nhăđó,ă nhóm kháng sinh imipenem, các ch ngăđ u th hi n m c nh y c m m nh, tr ch ng 12 kháng v i imipenem. Trongăkhiăđó,ăt t c 05 ch ng đ u kháng v i ciprofloxacin ( c ch t ng h p axit nucleic) và cefazolin ( c ch t ng h p thành t bào). K t qu cóătínhăt ngăđ ng v i các nghiên c uătr căđây,ăcácă ch ngăLABăđãăđ c báo cáo là nh y c m v i ampicillin [76]. Bên c nhăđó,ăkh n ngă kháng ciprofloxacin t nhiên c a các ch ng vi khu nălacticăc ngăđ c tìm th y trong các nghiên c uătr c [68]. Hi n nay, v năđ các ch ng probiotic có kh n ngăkhángă khángăsinhăcóăđ c coi là an tồn hay khơng v năcịnăđangăđ c tranh lu n. Các báo cáoătr căđâyăchoăr ng b n ch t kháng kháng sinh n i t i c a men vi sinh LAB cho th y ng d ng c a chúng cho c m căđíchăđi u tr và phịng ng aătrongăđi u tr và ki m soát nhi mătrùngăđ ng ru t,ăđ c bi tăkhiăchúngăđ c s d ngăđ ng th i cùng v i kháng sinh [77]. Các l i khu n có kh n ngăkhángăn i sinh có th ph c h i nhanh chóng h vi khu năđ ng ru tăsauăkhiăđi u tr b ng kháng sinh [78]. Tuy nhiên, ch ph m sinh h c ph iăanătồnăchoăconăng iăvàăkhơngăđ c có các gen kháng kháng sinh có th chuy n giao [62].ăDoăđó,ăc n có các nghiên c uăsâuăh nănh măđánhăgiáă s hi n di n c a các gen kháng kháng sinh và kh n ngăchuy n gen kháng tr c khi đ aăra các ngăviênăprobioticăđ đi u ki năđ phát tri n các s n ph m probiotic.
3.5.ă nh danh các ch ng ti măn ng
Các ch ng ti măn ngăsauăkhiăđ căđánhăgiáăcácăy u t kháng VSV ch th và cácăđ c tính c a probiotics đ căđnh danh b ng ph ngăpháp gi i trình t vùng 16S rRNA v i c p m iă đ c hi uă LPW57ă (5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)ă vàă LPW205ă(5’-CTTGTTACGACTTCACCC-3’) [57]. Trình t vùngă16SărRNAăđ c đ i chi u v i ngân hàng gen NCBI b ng ph n m măBLASTănucleotideăđ ch n k t qu choăđ t ngăđ ng cao nh t. K t qu BLAST nucleotide vùng 16S rRNAăđ c
B ng 3.5. K t qu đnh danh các ch ng ti măn ngăb ngăph ngăphápăgi i trình t vùng 16S rRNA Kí hi u ch ng Tên ch ng t ngăđ ng 12 Leuconostoc mesenteroides 99,71% 18 Weissella confusa 99,86% 22 Weissella confusa 98,89% 23 Weissella confusa 98,66% 27 Pediococcus pentosaceus 99,3%
K t qu đnh danh cho th y trong 05 ch ng ti mă n ng,ă cóă 01 ch ng Leuconostoc mesenteroides (phân l p t phân heo nhà), 03 ch ng Weissella confusa (phân l p t ru t và phân heo r ng), 01 ch ng Pediococcus pentosaceus phân l p t ru t heo nhà, các ch ngănàyăđ u thu c nhóm vi khu n lactic [68]. Trong nghiên c u c a Z. Benmechernene và c ng s , hai ch ng Leuconostoc mesenteroides B7 và Z8 phân l p t s a l căđàăchoăth y kh n ngă c ch m nh s phát tri n c a Listeria spp, Staphylococcus aureus và các ch ngănàyămangăđ c tính c aăprobioticănh ăt l s ng cao pH th p (2; 3 và 4) v i 0,5%, 1% và 2% mu i m t; ch ng L. mesenteroides B7 đ c xác đnh có kh n ngă sinhă bacteriocină làă leucocină B [79]. Ch ng L. mesenteroides SJRP55ăđ c phân l p t phô mát mozzarella th hi n kh n ngăkh liên h p mu i m t, chuăđ căđi u ki n kh c nghi t c aăđ ng tiêu hóa; kh n ngă bám dính t t,…ă[80]. K đ n, ch ng vi khu n Pediococcus pentosaceus làăđ iăt ng đãăđ c ch ng minh là ch ng probiotic ti măn ng,ăv i các ng d ng trong công nghi p th c ph mănh trong quá trình s n xu t kim chi và bánh mì, nem chua vì kh n ngălênămenăvàăsinhăraăcácăch t kháng khu n và n m m c t nhiên c a chúng. V i kh n ngăs n xu tăglucansucraseăhàmăl ng cao, P. pentosaceus đãăđ c ng d ng trong quá trình s n xu t s a vì chúng góp ph n t oănênăh ngăv cho các s n ph m s a [81]. Trongăl nhăv c nông nghi păvàăch nănuôi,ăP. pentosaceus đãăc i thi n các đ c tính và kh n ngăsinhătr ng c aăđ ng v t, có th k đ nănh ăP. pentosaceus B49 phân l p t s a non c aăng i có th làm gi m táo bón b ng cách c i thi nănhuăđ ng ru t,ăt ngăkh n ngăh p th n căvàăđi n gi i,ăthúcăđ y quá trình d n truy n th n kinh
vàăthúcăđ y các l i khu n s n xu t các axit béo chu i ng n [82]. Vi c k t h p v i ba lo i LAB khác, P. pentosaceus LUHS183 tham gia vào q trình axit hóa th că n,ă d năđ n c i thi năđángăk các ch s huy t h c, phân b VSV đ ng ru tăvàăt ngă tr ng c a l n con [83]. So v i các ch ng LAB khác, Weissella là m t chi m i và đ c t p trung nghiên c u vào nh ngăn măg năđây,ăv i nh ngăđ c tính c a l i khu n đãă đ c ch ngă minhă nh ă kh n ngă s n xu t bacteriocins, exopolysaccharides, diacetyl, H2O2,... có kh n ngăkhángăkhu n [84], kh n ng chuăđi u ki n axit và mu i m t c aăđ ng ru t [58], kh n ngăbámădínhăvàăt ngăsinhăt tătrongăđ ng ru t [58, 85]. W. confusa phân l p t ru tăcáăđ c tìm th y có kh n ngăs n sinh ra folate, ch t này đóngăvaiătrịăquanătr ng trong vi c sao chép, s a ch a DNA và methy hóa, folate c ngăcóăth ho tăđ ngănh ăch t ch ng oxy hóa [86]. Bên c nh nh ng l i ích c a chúng, Weissella confusa v năđangăđ c cân nh c s d ng r ng rãi vì m t s lo ng i v r i ro ti m n c aăchúngănh ăkh n ngătanămáu,ăkh n ngălanătruy n gen kháng khángăsinh,…ă[87]. Tuy nhiên, n mă2011,ă m t s loài Weissella, bao g m c W. confusa đãăđ c thêm vào danh sách các VSV đ c phép lên men trong th c ph m c aăLiênăđoànăs a Qu c t (International Dairy Federation ậ IDF) [87]. y ban v các tác nhân sinh h c c aă c (The German Committee for Biological Agents)ăđãă x p W. confusa vào nhóm khơng có kh n ngăgâyăb nhăchoăconăng i [87]. Tóm l i, W. confusa v n là m tăđ iăt ng probiotic đ y ti măn ng,ăbênăc nhăđó,ăc n ph i thi t l p h s ăđánhăgiáăđ an toàn c aăchúngăđ có th ng d ng r ng rãi trongăt ngălai.
3.6.ă ánhăgiáăm căđ đápă ng mi n d ch c a t bào ru t Caco-2 đ i v i ch ng VSV ti măn ng
Trong nhóm 05 ch ng VSV ti măn ngăđãăđ c kh o sát, ch ng 23 (Weissella confusa) phân l p t ru t heo r ng lai và ch ng 27 (Pediococcus pentosaceus) phân l p t ru tăheoănhàăđãăghiănh n có kh n ngă c ch c hai ch ng vi khu n ch th E. coli (18,33 ± 2,67mm và 15,67 ± 2,00mm) và S. typhimurium (l năl t là 3,33 ± 0,67mm và 3,33 ± 0,67mm),ăđ ng th i th hi năcácăđ cătínhăprobioticăv t tr iănh ă kh n ngăch uăđi u ki n axit và mu i m tătrongăđi u ki n kh o sát; kh n ngăbámă dínhăv t tr i trên t bào bi u mô ru tă(97%ăvàă72%),ăcaoăh năh n so v i các ch ng còn l i, kh n ngăbámădínhătrênăCaco-2 t tăc ngăgiúpăhaiăch ng này c ch s bám
dính c a E. coli c 3 nghi m th c c nh tranh, thay th và c ch .ăDoăđó,ăch ng 23 vàă27ăđ c l a ch n là đ iăt ng ti măn ngănh tăđ th nghi m kh n ngăđi u ch nh đápă ng mi n d ch c a t bào.
Vi sinh v t gây b nh khi xâm nh păvàoăc ăth v t ch theoăconăđ ng tiêu hóa có th bám vào b m t niêm m c ru tăđ gi i phóng các ch tăgâyăđ c, gây tiêu ch y, viêm nhi măđ ng ru t [70]. LPS là thành ph n chính c a thành t bào c a vi khu n Gram âm. LPS là các phân t l ng tính có thành ph n k n c (bao g m lipid A) và ph nă aăđ c (g mălõiăcarbohydrateăvàăpolysaccharide)ăvàăđ c gi i phóng kh i thành t bào vi khu n b ng cách phân h y ho c qua quá trình ly gi i c a vi khu n [88]. N ngăđ LPS cao nh tăđ c ghi nh n là trong lòng ru t,ăn iăc ătrúăc a các vi khu năđ ng ru t.ăThôngăth ng, LPS trong lịng ru t khơng thâm nh păquaăđ c l p bi u mô ru t;ătuyănhiên,ăkhiăc ăth b r i lo n tính th m ru t, hàng rào bi u mơ ru t b l ng và khi m khuy t, lúc này LPS có th th m qua và kích thích ph n ng viêm ru t [88]. LPS s kích thích t bào s n xu t quá m c các cytokine ti năviêmănh ă IL-6, IL-8, TNF-,… t đóăkích thích t bào, gây ra ph n ng viêm quá m c có th d n d n các tri u ch ngănh ,ăviêmăru t ho i t , nhi m trùng huy t…[62, 88].
mơ hình nghiên c u in vitro, t bào bi u mô ru t Caco-2 đ cănuôiătrênăđ aă 24 gi ng v i m tăđ t bào là 2x105 t bào/ gi ng, sau 24 gi , t bào đ c x lí v i các ch ng probiotic v i m tăđ đ u vào 106 CFU/mL vàăđ c kích thích v i LPS (1g/mL)ăđ kích thích q trình viêm trong t bào Caco-2. Sau 24 gi kích thích LPS,ătácăđ ngăđápă ng mi n d ch c a các ch ng probiotic trên t bào bi u mô ru t đ căđánhăgiáăthôngăquaăm căđ bi u hi n các cytokines ti n viêmănh ăIL-6, IL-8, TNF- b ngăph ngăphápăđ nhăl ng mRNA trong t bào. K t qu nhăh ng c a hai ch ng probiotic này đ c th hi n Hình 3.8.
Các t bào Caco-2ăđ c x lí v i LPS cho th y m căđ phiên mã IL-6 và TNF-
t ngăđángăk so v iănhómăđ i ch ng khơng x lí LPS. Ch ng 23 và 27 cho th y
khơng kích thích q trình viêm c a t bào Caco-2, vì m căđ phiên mã c a các cytokine ti năviêmăkhôngăt ngăsoăv iăđ i ch ng. Khi t bào Caco-2ăđ c x lí b ng LPSăđ ng th i v i ch ng 23 và 27, m c mRNA c a IL-6 và TNF- đãăgi m đángăk
so v i th nghi m ch x lí v i LPS. Ch ng 23 và 27 cho th y m căđ phiên mã c a IL-6 gi m l năl t là 21,54% và 55,25% so v iăđ i ch ng LPS. M căđ phiên mã c a mRNA TNF- gi m 78,77% và 88,40% khi có m t ch ng 23 và 27, so v i khi t bào Caco-2 x líăLPSăđ năl . i u này cho th y r ng, hai ch ng này có kh n ngăđi u hịa mi n dchăđ i v i s bi u hi n c a các cytokine ti n viêm. Ch ng 27 cho th y kh n ngăgi m m căđ bi u hi n cytokine gây viêm t tăh năsoăv i ch ng 23.
Hình 3.8. nhăh ng c a ch ng 23 (Weissella confusa) và ch ng 27 (Pediococcus pentosaceus) trên bi u hi n gen c a các cytokine ti n viêm
K t qu đ c bi u th d i d ng giá tr trung bình c a hai thí nghi măđ c l pă±ăđ l ch chu n, v i ** P < 0.01; *** P < 0.001 và **** P < 0.0001 so v i nhóm ch x lí v i LPS.
K t qu c a nghiên c uăc ngăt ngăt v i k t qu c a các nghiên c uătr c đây. Cácăbáoăcáoătr căđâyăchoăr ng ch ph m probiotic có th t ngătácătr c ti p v i các các t bào bi u mơ ru t,ăgiúpăđi u ch nh tình tr ng viêm do LPS gây ra [89]. Các ch ng Weissella confusa đ c phân l p t bánh g o lên men và phân su tr s ă sinh trong nghiên c u c a S. Singh và c ng s n mă2018ăchoăth y chúng có kh n ngă c ch s ti t nitric oxide và IL-6 do LPSăgâyăraătrênăđ i th c bào chu t RAW 264.7; đ ng th i m căđ ti t IL-8 c a t bào Caco-2 b kích thích b i LPS gi m đángăk khi có m t các ch ng W. confusa này [89]. Trong nghiên c u c a L. Huang và c ng s , ch ng W. confusa MW01 làm gi m s bi u hi n mRNAvà gi m m c đ ti t IL-6, IL- 8 và TNF- ătrongăt bào Caco-2ăđ c kích viêm b i LPS [58]. Vì v y, tác d ngăđi u ch nhăđápă ng mi n d ch c a vi khu năđ i v i t bào bi u mơ có th đóngăvaiătrịătíchă
c c trong vi c h n ch các ph n ng viêm trong q trình viêm ru t mãn tính, giúp c i thi n các đi u ki n sinh lí c a ru t [58].
Nh ăv y, mơ hình nghiên c u in vitro, ch ng 23 (Weissella confusa) và ch ng 27 (Pediococcus pentosaceus) đãăth hi n kh n ngăđi uăhòaăđápă ng mi n d ch trong t bào m căđ phiên mã thông qua s gi m bi u hi n c a mRNA IL-6 và TNF-a trong t bào Caco-2 b kích thích b i LPS. Ngồi ra, c n có các nghiên c u ti p theo nh măđánhăgiáăkh n ngăđi u hòa m căđ d ch mã ho căđánhăgiáătrênămơă hình in vivo đ th yăđ cătácăđ ng c aăchúngăđ i v i v t ch ng.
CH NGă4.ăK T LU N VÀ KI N NGH 4.1. K t lu n