HoƠng V n L u đư xác đ nh hƠm l ng vƠ thƠnh ph n tinh d u lá, n , hoa v i m t vùng t i Ngh An; tách vƠ xác đ nh c u trúc m t s flavonoid (β' 4'- dihydroxy-6methoxy-γ'5’-dimethyl chalcone, 5,7-dihydroxy-6,8-dimethyl flavanone, 7-Hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethyl flavanone, acid cinnamic, acid
oleanic) t n vƠ (acid oleanic, Bsitosterol) t v v i [11].
Ơo Th Thanh Hi n đư nghiên c u m t s ho t tính sinh h c c a lá v i bao g m tác d ng kháng khu n, tác d ng l i m t vƠ kh n ng gơy đ c t bƠo. K t qu th tác d ng kháng khu n cho th y lá v i đ i v i E. coli, lo i vi khu n hay gơy b nh đ ng ru t, hai vi khu n Gram d ng th nghi m, lo i vi khu n hay g p b nh
viêm da.
N c s c lá v i u có tác d ng l i m t r t m nh, tác d ng đ c t bƠo c a 4 m u th trích ly | t lá v i b c đ u cho th y c tinh d u vƠ cao khô toƠn ph n đ u có kh n ng c ch s phát tri n t bƠo ung th (ung th gan, ung th mƠng tim, ung
th t cung). i u nƠy m ra h ng nghiên c u m i đ i v i d c li u lá v i [β8]. Nhóm tác gi Trong Tuan Dao, Bui Thanh Tung vƠ các c ng s đư cho th y flavonoid methyl hóa phơn l p t C.operculatus có ti m n ng phát tri n thƠnh nh ng ch t c ch neurominidase c a virus cúm gia c m H1N1 [β8].
Nhóm tác gi Byung Sun Min vƠ c ng s đư đánh giá qua th nghi m c ch hai enzyme acetylcholinesterase vƠ butylrylchilineaterase (thu c nhóm tác nhơn gơy b nh Alzheimer), c 5 flavonoid tách t n v i: myricotin-γ’-methylether 3-O-B- Dgalactopyranosid, myricetin-3'-dimethylether 3-0-B-D-galactopyranosid,
quercetin, kaempfrol vƠ tamarixetin đ u th hi n tác đ ng c ch enzyme acetylcholinesterase v i IC50 l n l t lƠ 19.9; γ7.8; β5.9; γ0.4 vƠ ββ.γ µM, trong khi đó tác đ ng c ch butylrylchilineaterase ch th hi n v i flavonoid myricetin-
3'-methylether 3-O-B-Dgalactopyranosid, quercetin, kaempfrol vƠ tamarixetin v i giá tr IC50 l n l t lƠ 15β.5; 177.8; 6β,5 vƠ 160.6 µM [18].
TrƠ n v i đư đ c nghiên c u cho th y có kh n ng c ch Na+, K+, Cat -
ATPase trong tim chu t lƠm t ng s co bóp vƠ gi m t n s co bóp c a tim chu t. C ch tác đ ng c a trƠ n v i t ng đ i ch m h n tuy nhiên hi u qu n đ nh h n Ouabain (lƠ m t glucosid trích ly xu t t h t cơy Strophantus gratus, h trúc đƠo (Apocynaceae) có tác d ng ch a tr y tim m ch nhanh b ng cách tiêm t nh m ch)
[29].
Tinh d u đ c phơn l p t các n v i c ch đáng k s phát tri n c a vi khu n Gram ơm (P. aeruginosa) và Gram d ng, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), kháng Vancomycin Enterococci (VRE). N ng đ c ch t i thi u (MIC) vƠ n ng đ di t khu n t i thi u (MBC) c a tinh d u kháng l i các vi sinh v t th nghi m đư đ c tìm th y trong kho ng 1-20 ul /ml [30].
2.4. Nh ng s n ph m t cây v i hi năđang có trên th tr ng
- Hi n nay trên th tr ng xu t hi n r t nhi u d ng s n ph m có ngu n g c t cây v i nh : lá v i s y khô, n v i khô, b t lá v i. Các s n ph m đ u có cách s d ng t ng t nhau nh lƠ pha v i n c nóng ho c s d ng nh trƠ dùng đ u ng h ng ngày.
CH NGă3: V T LI UăVÀăPH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 3.1. Nguyên li u
Lá v i đ c mua t i v n tr ng t i Th c, Lá đ c thu ho ch vƠo tháng γ/β0ββ, đ c l a ch n có kích th c đ ng đ u, kích th c lá 6-12 cm, lo i b các
lá vƠng vƠ h h ng. đem r a s ch v i n c, đ ráo. Ti p theo lá đ c đóng trong túi PE b o qu n trong ng n mát t l nh 5-7oC trong m t ngƠy cho đ n khi đem đi thí nghi m. Tiêu chí ch n lá đư giƠ, m t m t lá mƠu xanh đ m, m t còn l i mƠu vƠng nh t.
3.2. Thi t b , d ng c và hóa ch t, dung mơi
Hình 3. 1 Lá v i nguyên li u
3.2.1. Thi t b
- Máy đo quang ph PerkinElmer - B đi u nhi t (Memmert)
- Máy l c (Memmert)
- T s y (Memmert)
- Máy đo pH - Cơn đi n t 4 s l , β s l - Máy khu y t - Cơn s y m - B m chơn không - T đông, t l nh 3.2.2. D ng c - Bình đ nh m c 50ml, 100ml - Bình tam giác 250ml - C c th y tinh 100ml, 250ml - Ph u th y tinh - a th y tinh - Nhi t k - Bình hút chân khơng - ng nghi m có n p - Micropipette - Rây - Cuvet - Cá t
3.2.3. Hóa ch t, dung mơi
- Dung mơi: C n tuy t đ i
- Hóa ch t:
- Trolox (Merck, c)
- Methanol (Trung Qu c)
- Na2CO3 (Trung Qu c)
3.3. Ph ngăpháp nghiên c u
3.3.1. S ăđ nghiên c u
3.3.2. Quy trình trích ly d ch lá v i
Hình 3. 3 Quy trình trích ly d ch lá v i
Thuy t minh quy trình:
- Lá v i đ c thu mua và v n chuy n v phịng thí nghi m. Lá v i đ c ti n hành làm s ch đ lo i v t p ch t, lá h ngầ sau đó đ c r a s ch vƠ đ ráo t nhiên.
- Ch n: lá v i sau khi đ c làm ráo t nhiên ti n hành kh o sát nhi t đ ch n v i nhi t đ trong kho ng 70-100oC trong th i gian 5-γ0 giơy đ ch n đ c thông s phù h p cho các quá trình ti p theo. M c đích c a quá trình này nh m b t ho t các emzyme polyphenol oxidase có trong lá v i.
- Làm ngu i nhanh: lá v i sau khi ch n đ c v t ra ngoƠi vƠ đ c làm ngu i nhanh trong 5 phút nhi t đ (2-5oC) b ng n c đá l nh r i l y ra ngoƠi đ
đó, m c đ gi m ch t l ng v thành ph n dinh d ng và c m quan c a s n ph m s đ c gi m t i thi u.
- Xay: lá v i đ c xay nh m đ phá v c u trúc c a nguyên li u đ nâng cao hi u qu c a q trình trích ly. Kích th c c a ngun li u càng nh thì di n tích ti p xúc b m t nguyên li u và dung môi s càng l n. Lá v i sau khi ch n s đ c xay nh kích th c 0,5-1 mm b ng thi t b xay gián đo n (Philips Blender, HR2096/00). M i l n xay kho ng 100g lá trong 2 phút. - Trích ly: đơy lƠ q trình trích ly r n ậ l ng, dung môi đ c s d ng trong
nghiên c u nƠy lƠ n c ậ c n, dung môi th m th u vào trong các t bào c a lá. M c đích c a q trình này nh m kh o sát vƠ tìm ra đi u ki n t i u các
thông s c n kh o sát nh : nhi t đ trích ly, th i gian trích ly, n ng đ dung môi, t l nguyên li u/dung môi, pH.
- L c: m u sau q trình trích ly đ c ti n hành l c qua gi y l c có kích th c l 0,25mm. M c đích c a q trình này nh m t o ra m t h n h p huy n phù
đ ng nh t, đ ng th i đơy c ng lƠ b c chu n b cho quá trình s y phun.
3.3.3. Ph ngăphápăthi t k thí nghi m Thí nghi m kh oăsátăs ăb
M c đích c a thí nghi m kh o sát là sàng l c các thông s (y u t kh o sát)
nh h ng có Ủ ngh a lên hi u qu thu h i flavonoid b ng ph ng pháp th c nghi m m t y u t m t th i gian. C th các y u t s đ c l n l t kh o sát đ c l p, khi m t y u t kh o sát thì các y u t cịn l i đ c c đnh m t m c đ c l a ch n. Ph ng pháp phơn tích ph ng sai m t chi u (one-way ANOVA) và LSD (Least Significant Difference) đ c s d ng đ so sánh hi u qu gi a các m c y u t v i = 0,05.
Thí nghi m t iă uăhóa
M c đích c a thí nghi m nƠy lƠ xác đ nh t i u hóa q trình trích ly, đ thu h i hi u qu flavonoid cao nh t. t i u quy trình trích ly, mơ hình CCRD (Central Composite Rotatable Design) v i 4 y u t và 5 m c đ c s d ng trong
nghiên c u này. Kho ng bi n thiên c a các bi n đ c xác đ nh d a trên k t qu kh o sát tr c đó. HƠm m c tiêu đ i di n cho hi u qu trích ly lƠ hƠm l ng flavonoid thu h i.
3.4. Kh o sát nhăh ng c a quá trình ch n 3.4.1. Kh o sát nhăh ng nhi tăđ ch n
Thíănghi mă1:Kh o sát nh h ng c a nhi t đ ch n Thông s kh o sát:
Nhi t đ ch n (oC): 70, 80, 90, 100
Thông s c đ nh:
Th i gian ch n (giây): 30
T l nguyên li u/dung môi: 1/10
N ng đ dung môi Ethanol (%): 50 Th i gian trích ly (phút): 45
Nhi t đ trích ly (oC): 50
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.2. Kh o sát nhăh ng c a th i gian ch n Thíănghi mă2:Kh o sát nh h ng c a th i gian ch n Thông s kh o sát:
Th i gianch n (giây): 15, 30, 45, 60, 75, 90
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1
T l nguyên li u/dung môi: 1/10
Th i gian trích ly (phút): 45 Nhi t đ trích ly (oC): 50
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.3. Kh o sát nhăh ng c a n ngăđ dung mơi
Thíănghi mă3:Kh o sát nh h ng c a n ng đ dung môi.
Thông s kh o sát:
N ng đ dung môi Ethanol (%v/v): 40, 50, 60, 70
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1
Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β T l nguyên li u/dung môi: 1/10
Th i gian trích ly (phút): 45 Nhi t đ trích ly (oC): 50
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.4. Kh o sát nhăh ng c a nhi tăđ trích ly Thíănghi mă4:Kh o sát nh h ng c a nhi t đ trích ly Thơng s kh o sát:
Nhi t đ trích ly (oC): 40, 50, 60, 70, 80
Thơng s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1 Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
T l ngun li u/dung mơi: 1/10 Th i gian trích ly (phút): 45
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.5. Kh o sát nhăh ng c a th i gian trích ly Thíănghi mă5:Kh o sát nh h ng c a th i gian trích ly Thơng s kh o sát:
Th i gian trích ly (phút): 10, β0, γ0, 40, 50, 60, 70, 80
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1
Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
N ng đ dung môi Ethanol (%): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m γ Nhi t đ trích ly (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 4
T l nguyên li u/dung môi: 1/10
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.6. Kh o sát nhăh ng c a t l nguyên li u/dung mơi Thíănghi mă6:Kh o sát nh h ng c a t l nguyên li u/dung môi
Thông s kh o sát:
T l nguyên li u/dung môi: 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1 Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
Nhi t đ trích ly (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 4 Th i gian trích ly (phút): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 5 pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH 3.4.7. Kh o sát nhăh ng c a pH Thíănghi mă7:Kh o sát nh h ng c a pH Thông s kh o sát: pH: 4,0; 4,5; 5,0; 5,6; 6,0; 6,5 Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1 Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
N ng đ dung môi Ethanol (%): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m γ Nhi t đ trích ly (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 4
Th i gian trích ly (phút): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 5 T l nguyên li u/dung môi: giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 6 HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.5. Kh oăsátăđi u ki n t iă uăhóaăqătrìnhătríchălyăFlavonoidătrongăláăv i
B trí thí nghi m t i u hóa q trình trích ly polyphenol t lá V i đ c ti n hƠnh theo mơ hình β m c (Level Factorial Design) v i 4 y u t nh h ng lƠ nh h ng c a các nhơn t chi t: Nhi t đ trích ly (X1 ), th i gian trích ly (Xβ ), t l nguyên li u/dung môi (Xγ ) vƠ n ng đ ethanol (X4 ). Kho ng gi i h n c n trên vƠ d i c a b n y u t X1, Xβ, X3, X4 đ c rút ra t k t qu các thí nghi m β.5.1,
2.5.2, 2.5.3, 2.5.4, 2.5.5, 2.5.6, 2.5.7. HƠm m c tiêu Y đ c ch n lƠ hƠm l ng
Mơ hình tốn h c mơ t nh h ng c a các bi n đ c l p đ i v i bi n ph thu c có d ng hƠm đa th c b c hai có d ng t ng quát nh sau:
Trong đó:
Yk : Bi n ph thu c (k = 1 - 4)
Xi,j: Nhân t mã hóa c a bi n đ c l p nh h ng đ n Yk B0 : H s h i qui b c 0
Bj : H s h i qui b c 1 mô t nh h ng c a bi n Xj đ n Yk Bij: H s nh h ng đ ng th i c a bi n Xi và Xj đ n Yk Bjj: H s h i qui b c hai mô t nh h ng c a bi n X2j đ n Yk
xác đ nh đ c các thông s t i u c a các thông s X1, X2, X3, X4 nh h ng đ n hi u su t trích ly Flavonoid
S thí nghi m N= kβ + βk + cp v i k các y u t cịn cp lƠ s thí nghi m trung tơm đ c th c hi n l p l i (N=β7; k=4; cp = γ). Trong đó, k lƠ s bi n s đ c l p vƠ βk s thí nghi m b sung t i (giá tr còn đ c g i lƠ đi m ắsao” hay cánh tay đòn). Kho ng cách t tơm đ n đi m sao = βk/4 ( = β v i k=4). T t c các nghiên c u đ c th c hi n 5 m c (- , -1, 0, +1, + ). Nh v y, trong nghiên c u
ngƠy β7 thí nghi m s đ c th c hi n v i β4=16 thí nghi m toƠn ph n hai m c trên d i, β x 4 = 8 thí nghi m đi m sao n m cách v trí th c nghi m m t kho ng ± , γ thí nghi m đ c l p l i tơm.
B ng 3. 1 Ma tr n b trí thí nghi m mã hóa các bi n đ c l p
Tên bi n M c nghiên c u
Bi n th c - -1 0 1
X1: Nhi t đ trích ly (oC) 50 60 70 80 90
X2: Th i gian trích ly (phút) 40 50 60 70 80
X3: T l nguyên li u/dung môi (g/ml)
1/6 1/7 1/8 1/9 1/10
X4: N ng đ ethanol (%) 40 50 60 70 80
Ghi chú: = 2, Umax, Umin là giá tr c n trên (+ 1) và c n d i (-1) c a bi n đ c l p, U0 = (Umin + Umax)/2 là giá tr trung bình c a c n trên và c n d i.
K t qu thí nghi m thi t k theo mơ hình β Level Factorial Design thu đ c s đ c x lỦ b ng ch ng trình Design Expert 12 vƠ ti n hƠnh phơn tích đ ch n ra đ c đi u ki n trích ly t i u. Sau khi ch n đ c đi u ki n trích ly t i u, ti n hƠnh các thí nghi m t i các đi m thu c vùng quy ho ch đ đánh giá s phù h p gi a s li u th c nghi m v i s li u tính tốn t mơ hình.
3.6. ng d ng B t s y phun d chătríchăđ b sung ho t ch t choăn c gi i
khát h ngăcam
3.6.1. Xácăđnh ho t tính ch ng oxy hóa c aăn c gi i khát h ngăcamă
Sau khi d ch trích đ c thêm maltodextrin vƠ đem đi s y phun thu đ c b t mƠu vƠng vƠ ph i tr n theo công th c s n ph m n c gi i khát h ng cam có b sung ch t đi u ch nh đ acid vƠ đ c thanh trùng t i 85 oC trong vòng β phút. S n ph m đ c đánh giá nh ng ch tiêu sau:
3.6.2. Theo dõi s bi năđ iăhƠmăl ng TFC và ho t tính ch ng oxy hóa theo