Thuy t minh quy trình:
- Lá v i đ c thu mua và v n chuy n v phịng thí nghi m. Lá v i đ c ti n hành làm s ch đ lo i v t p ch t, lá h ngầ sau đó đ c r a s ch vƠ đ ráo t nhiên.
- Ch n: lá v i sau khi đ c làm ráo t nhiên ti n hành kh o sát nhi t đ ch n v i nhi t đ trong kho ng 70-100oC trong th i gian 5-γ0 giơy đ ch n đ c thông s phù h p cho các quá trình ti p theo. M c đích c a quá trình này nh m b t ho t các emzyme polyphenol oxidase có trong lá v i.
- Làm ngu i nhanh: lá v i sau khi ch n đ c v t ra ngoƠi vƠ đ c làm ngu i nhanh trong 5 phút nhi t đ (2-5oC) b ng n c đá l nh r i l y ra ngoƠi đ
đó, m c đ gi m ch t l ng v thành ph n dinh d ng và c m quan c a s n ph m s đ c gi m t i thi u.
- Xay: lá v i đ c xay nh m đ phá v c u trúc c a nguyên li u đ nâng cao hi u qu c a q trình trích ly. Kích th c c a nguyên li u càng nh thì di n tích ti p xúc b m t nguyên li u và dung môi s càng l n. Lá v i sau khi ch n s đ c xay nh kích th c 0,5-1 mm b ng thi t b xay gián đo n (Philips Blender, HR2096/00). M i l n xay kho ng 100g lá trong 2 phút. - Trích ly: đơy lƠ q trình trích ly r n ậ l ng, dung môi đ c s d ng trong
nghiên c u nƠy lƠ n c ậ c n, dung môi th m th u vào trong các t bào c a lá. M c đích c a q trình này nh m kh o sát vƠ tìm ra đi u ki n t i u các
thông s c n kh o sát nh : nhi t đ trích ly, th i gian trích ly, n ng đ dung môi, t l nguyên li u/dung môi, pH.
- L c: m u sau q trình trích ly đ c ti n hành l c qua gi y l c có kích th c l 0,25mm. M c đích c a quá trình này nh m t o ra m t h n h p huy n phù
đ ng nh t, đ ng th i đơy c ng lƠ b c chu n b cho quá trình s y phun.
3.3.3. Ph ngăphápăthi t k thí nghi m Thí nghi m kh oăsátăs ăb
M c đích c a thí nghi m kh o sát là sàng l c các thông s (y u t kh o sát)
nh h ng có Ủ ngh a lên hi u qu thu h i flavonoid b ng ph ng pháp th c nghi m m t y u t m t th i gian. C th các y u t s đ c l n l t kh o sát đ c l p, khi m t y u t kh o sát thì các y u t còn l i đ c c đnh m t m c đ c l a ch n. Ph ng pháp phơn tích ph ng sai m t chi u (one-way ANOVA) và LSD (Least Significant Difference) đ c s d ng đ so sánh hi u qu gi a các m c y u t v i = 0,05.
Thí nghi m t iă uăhóa
M c đích c a thí nghi m nƠy lƠ xác đ nh t i u hóa q trình trích ly, đ thu h i hi u qu flavonoid cao nh t. t i u quy trình trích ly, mơ hình CCRD (Central Composite Rotatable Design) v i 4 y u t và 5 m c đ c s d ng trong
nghiên c u này. Kho ng bi n thiên c a các bi n đ c xác đ nh d a trên k t qu kh o sát tr c đó. HƠm m c tiêu đ i di n cho hi u qu trích ly lƠ hƠm l ng flavonoid thu h i.
3.4. Kh o sát nhăh ng c a quá trình ch n 3.4.1. Kh o sát nhăh ng nhi tăđ ch n
Thíănghi mă1:Kh o sát nh h ng c a nhi t đ ch n Thông s kh o sát:
Nhi t đ ch n (oC): 70, 80, 90, 100
Thông s c đ nh:
Th i gian ch n (giây): 30
T l nguyên li u/dung môi: 1/10
N ng đ dung mơi Ethanol (%): 50 Th i gian trích ly (phút): 45
Nhi t đ trích ly (oC): 50
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.2. Kh o sát nhăh ng c a th i gian ch n Thíănghi mă2:Kh o sát nh h ng c a th i gian ch n Thông s kh o sát:
Th i gianch n (giây): 15, 30, 45, 60, 75, 90
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1
T l nguyên li u/dung mơi: 1/10
Th i gian trích ly (phút): 45 Nhi t đ trích ly (oC): 50
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.3. Kh o sát nhăh ng c a n ngăđ dung mơi
Thíănghi mă3:Kh o sát nh h ng c a n ng đ dung môi.
Thông s kh o sát:
N ng đ dung môi Ethanol (%v/v): 40, 50, 60, 70
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1
Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β T l nguyên li u/dung mơi: 1/10
Th i gian trích ly (phút): 45 Nhi t đ trích ly (oC): 50
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.4. Kh o sát nhăh ng c a nhi tăđ trích ly Thíănghi mă4:Kh o sát nh h ng c a nhi t đ trích ly Thơng s kh o sát:
Nhi t đ trích ly (oC): 40, 50, 60, 70, 80
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1 Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
T l nguyên li u/dung môi: 1/10 Th i gian trích ly (phút): 45
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.5. Kh o sát nhăh ng c a th i gian trích ly Thíănghi mă5:Kh o sát nh h ng c a th i gian trích ly Thơng s kh o sát:
Th i gian trích ly (phút): 10, β0, γ0, 40, 50, 60, 70, 80
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1
Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
N ng đ dung môi Ethanol (%): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m γ Nhi t đ trích ly (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 4
T l nguyên li u/dung môi: 1/10
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.4.6. Kh o sát nhăh ng c a t l nguyên li u/dung mơi Thíănghi mă6:Kh o sát nh h ng c a t l nguyên li u/dung môi
Thông s kh o sát:
T l nguyên li u/dung môi: 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11
Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1 Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
Nhi t đ trích ly (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 4 Th i gian trích ly (phút): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 5 pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH 3.4.7. Kh o sát nhăh ng c a pH Thíănghi mă7:Kh o sát nh h ng c a pH Thông s kh o sát: pH: 4,0; 4,5; 5,0; 5,6; 6,0; 6,5 Thông s c đ nh:
Nhi t đ ch n (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 1 Th i gian ch n (giơy): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m β
N ng đ dung môi Ethanol (%): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m γ Nhi t đ trích ly (oC): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 4
Th i gian trích ly (phút): giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 5 T l nguyên li u/dung môi: giá tr t t nh t thu đ c thí nghi m 6 HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
3.5. Kh oăsátăđi u ki n t iă uăhóaăqătrìnhătríchălyăFlavonoidătrongăláăv i
B trí thí nghi m t i u hóa q trình trích ly polyphenol t lá V i đ c ti n hƠnh theo mơ hình β m c (Level Factorial Design) v i 4 y u t nh h ng lƠ nh h ng c a các nhơn t chi t: Nhi t đ trích ly (X1 ), th i gian trích ly (Xβ ), t l nguyên li u/dung môi (Xγ ) vƠ n ng đ ethanol (X4 ). Kho ng gi i h n c n trên vƠ d i c a b n y u t X1, Xβ, X3, X4 đ c rút ra t k t qu các thí nghi m β.5.1,
2.5.2, 2.5.3, 2.5.4, 2.5.5, 2.5.6, 2.5.7. HƠm m c tiêu Y đ c ch n lƠ hƠm l ng
Mơ hình tốn h c mơ t nh h ng c a các bi n đ c l p đ i v i bi n ph thu c có d ng hƠm đa th c b c hai có d ng t ng quát nh sau:
Trong đó:
Yk : Bi n ph thu c (k = 1 - 4)
Xi,j: Nhân t mã hóa c a bi n đ c l p nh h ng đ n Yk B0 : H s h i qui b c 0
Bj : H s h i qui b c 1 mô t nh h ng c a bi n Xj đ n Yk Bij: H s nh h ng đ ng th i c a bi n Xi và Xj đ n Yk Bjj: H s h i qui b c hai mô t nh h ng c a bi n X2j đ n Yk
xác đ nh đ c các thông s t i u c a các thông s X1, X2, X3, X4 nh h ng đ n hi u su t trích ly Flavonoid
S thí nghi m N= kβ + βk + cp v i k các y u t còn cp lƠ s thí nghi m trung tơm đ c th c hi n l p l i (N=β7; k=4; cp = γ). Trong đó, k lƠ s bi n s đ c l p vƠ βk s thí nghi m b sung t i (giá tr còn đ c g i lƠ đi m ắsao” hay cánh tay đòn). Kho ng cách t tơm đ n đi m sao = βk/4 ( = β v i k=4). T t c các nghiên c u đ c th c hi n 5 m c (- , -1, 0, +1, + ). Nh v y, trong nghiên c u
ngƠy β7 thí nghi m s đ c th c hi n v i β4=16 thí nghi m toƠn ph n hai m c trên d i, β x 4 = 8 thí nghi m đi m sao n m cách v trí th c nghi m m t kho ng ± , γ thí nghi m đ c l p l i tơm.
B ng 3. 1 Ma tr n b trí thí nghi m mã hóa các bi n đ c l p
Tên bi n M c nghiên c u
Bi n th c - -1 0 1
X1: Nhi t đ trích ly (oC) 50 60 70 80 90
X2: Th i gian trích ly (phút) 40 50 60 70 80
X3: T l nguyên li u/dung môi (g/ml)
1/6 1/7 1/8 1/9 1/10
X4: N ng đ ethanol (%) 40 50 60 70 80
Ghi chú: = 2, Umax, Umin là giá tr c n trên (+ 1) và c n d i (-1) c a bi n đ c l p, U0 = (Umin + Umax)/2 là giá tr trung bình c a c n trên và c n d i.
K t qu thí nghi m thi t k theo mơ hình β Level Factorial Design thu đ c s đ c x lỦ b ng ch ng trình Design Expert 12 vƠ ti n hƠnh phơn tích đ ch n ra đ c đi u ki n trích ly t i u. Sau khi ch n đ c đi u ki n trích ly t i u, ti n hƠnh các thí nghi m t i các đi m thu c vùng quy ho ch đ đánh giá s phù h p gi a s li u th c nghi m v i s li u tính tốn t mơ hình.
3.6. ng d ng B t s y phun d chătríchăđ b sung ho t ch t choăn c gi i
khát h ngăcam
3.6.1. Xácăđnh ho t tính ch ng oxy hóa c aăn c gi i khát h ngăcamă
Sau khi d ch trích đ c thêm maltodextrin vƠ đem đi s y phun thu đ c b t mƠu vƠng vƠ ph i tr n theo công th c s n ph m n c gi i khát h ng cam có b sung ch t đi u ch nh đ acid vƠ đ c thanh trùng t i 85 oC trong vòng β phút. S n ph m đ c đánh giá nh ng ch tiêu sau:
3.6.2. Theo dõi s bi năđ iăhƠmăl ng TFC và ho t tính ch ng oxy hóa theo th i gian b o qu n.
Thông s kh o sát: th i gian b o qu n l n l t đ c kh o sát lƠ 0, γ, 6, 9, 1β,
15, 18, 21, 24, 27, 30 ngày.
Thông s c đ nh: nhi t đ b o qu n 5 ậ 10 oC
ảàm m c tiêu: DPPH
3.7. Cácăph ngăphápăphơnătích
3.7.1. Ph ngăphápăxácăđ nhăđ m nguyên li u
m c a nguyên li u đ c xác đ nh b ng ph ng pháp s y đ n kh i l ng không đ i, s d ng thi t b đo đ m h ng ngo i.
3.7.2. Ph ngăphápăxácăđ nhăhƠmăl ng flavonoid t ng
HƠm l ng flavonoid t ng đ c xác đ nh d a vƠo đ c tính t o ph c mƠu r t m nh c a các flavonoid v i kim lo i Al3+ trong môi tr ng tr c quang b ng cách xơy d ng đ ng chu n v i Rutin, đo đ h p th quang h p b c sóng 415 nm [57]
3.7.3. Ph ngăphápăxácăđnh ho t tính ch ng oxy hóa
Ho t tính ch ng oxy hóa theo DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) đ c tham kh o theo ph ng pháp c a Molyneux vƠ c ng s (β004)[56].
3.8. Ph ngăphápăx lí s li u:
M i thí nghi m s l p l i γ l n vƠ k t qu đ c trình bƠy d i d ng giá tr trung bình ± đ l ch chu n.
S d ng ph n m m th ng kê minitap đ phơn tích th ng kê s li u thí nghi m vƠ đánh giá s khác bi t gi a các m u. Phơn tích ANOVA nh m ki m tra đ tin c y v i m c Ủ ngh a 5% đ đánh giá s khác bi t gi a các m u phơn tích có Ủ ngh a v m t th ng kê.
CH NGă4: K T QU VÀ TH O LU N
4.1. K t qu đoăm t s thành ph n trong nguyên li u lá v i
STT Thành ph n năv HƠmăl ng
1 m % Kh i l ng NL 69,50 ± 2,54
2 Tro % Kh i l ng ch t khô NL 3,45 ± 1,05
3 ng kh % Kh i l ng ch t khô NL 7,25 ± 0,7
4 Protein t ng % Kh i l ng ch t khô NL 4,70 ± 0,52
4.2. Kh o sát nhăh ng c a các thơng s c a các q trình đ năhƠmăl ng flavonoid và kh n ngăkhángăoxyăhóaăc a d ch trích ly
4.2.1. Kh o sát nhăh ng c a nhi tăđ ch n i uăki năch năvƠătrích ly:
Thơng s thay đ i:
Nhi t đ ch n (oC): 70, 80, 90, 100
Thông s c đ nh:
Th i gian ch n (giơy): γ0
T l nguyên li u/dung môi: 1/10
N ng đ dung môi Ethanol (%)(v/v): 50
Th i gian trích ly (phút): 45 Nhi t đ trích ly (oC): 50
pH: 5,6 (pH t nhiên c a lá nguyên li u) HƠm m c tiêu: TFC, DPPH
M u đ i ch ng lƠ m u khơng qua q trình ch n, đem xay tr c ti p v i dung môi ethanol 50%v/v, sau đó đem trích ly 50 trong 45 phút, sau đó l c qua gi y l c đo đ c hƠm l ng flavonoid t ng 14,βγ ± 1,4β (mg RE/g ch t khô nguyên li u), hƠm l ng DPPH 335,23 ± 10,75 (µmol TE/g ch t khơ ngun li u)
Hình 4. 1 nh h ng c a nhi t đ ch n đ n hàm l ng flavonoid
Hình 4. 2 nh h ng c a nhi t đ ch n đ n ho t tính ch ng oxy hóa theo DPPả
K tăqu
Quan sát t k t qu thí nghi m, ta nh n th y q trình ch n có nh h ng r t tích c c đ n vi c thu nh n các h p ch t flavonoid có ho t tính ch ng oxy hóa t lá v i. Khi t ng nhi t đ trong ph m vi t 70oC đ n 90oC hƠm l ng flavonoid vƠ DPPH đ u t ng so v i m u đ i ch ng. T i nhi t đ ch n 90oC hƠm l ng TFC vƠ DPPH l n l t đ t β7,5γ (mg RE/g ch t khô nguyên li u), 679,91 ± 4,11 (µmol
TE/g ch t khơnguyên li u). So v i m u đ i ch ng, quá trình ch n t i nhi t đ 90oC
21,64a 23,62a 27,53b 22,79a 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 70 80 90 100 H T FC R E DW N oC) TFC 589,08a 647,95b 679,91c 654,42b 520,00 540,00 560,00 580,00 600,00 620,00 640,00 660,00 680,00 700,00 70 80 90 100 H T E /g D W ) N oC) DPPH
giúp hƠm l ng flavonoid t ng đ n 19γ,5% vƠ ho t tính ch ng oxy hóa theo DPPH t ng β0β,8%, cao nh t trong các m u ch n. Khi ti p t c t ng nhi t đ ch n thì hàm
l ng TFC vƠ DPPH khơng t ng mƠ cịn có d u hi u gi m m nh. T i nhi t đ ch n
100oC, hƠm l ng TFC còn l i 8β,78% vƠ ho t tính ch ng oxy hóa theo DPPH còn l i 96,β5% so v i m u ch n t i nhi t đ 90oC.
Bàn lu n:
T k t qu thí nghi m cho th y nhi t đ ch n 90oC cho giá tr TFC (β7,5γ
± 1,81 (mg RE/g ch t khônguyên li u), vƠ hƠm l ng DPPH (679,91 ± 4,11 µmol
TE/g ch t khô nguyên li u) đ t giá tr cao nh t. Q trình ch n đơy có tác d ng lƠ vô ho t enzyme polyphenol oxidase (PPO), lƠ tác nhơn chính gơy ra hi n t ng oxy hóa các h p ch t polyphenol có trong nguyên li u.
Enzyme PPO b b t ho t t 70-90oC nh ng đ có th b t ho t đ c hoƠn toƠn