Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn
Tiến hành theo phương pháp của O’Toole và Kolter (1998); Morikawa và cộng sự (2006). [33, 35]
Làm tươi mới chủng tạo biofilm:
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MPA dịch. Sau 14 - 16 h nuôi cấy, đem ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4.000 rpm, 4oC trong vòng 10 phút và rửa nước cất 2 lần với thể tích tương ứng). Bổ sung nước cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối. Tiến hành pha loãng tới hạn và đo OD ở
bước sóng 600 nm, pha lỗng dịch sinh khối bằng nước cất để đạt OD là 0,3. Bổ
sung 1% dịch này vào các eppendorf chứa 297 μl mơi trường MPA. Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày. Các mẫu được nuôi ở tủ ấm 30oC và
đánh giá khả năng tạo biofilm sau 24, 48 và 72 h.
Kiểm tra khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn
Nguyên lý:
Thành tế bào vi khuẩn trong biofilm có khả năng bắt giữ tím tinh thể sau khi nhuộm cố định ở nhiệt độ phòng. Khi bổ sung dung dịch axít acetic 33% sau nhuộm có tác dụng loại bỏ tím tinh thể ra khỏi thành tế bào vi khuẩn, lúc này các tím tinh thể sẽ được giải phóng và hịa tan trong dung mơi. Giá trị OD ở bước sóng 570 nm thể hiện độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch tím tinh thể và tỷ lệ với lượng tím tinh
25
thể được cố định, tức đặc trưng cho mật độ tế bào trong cấu trúc biofilm hay nói
cách là khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn tương ứng.
Tiến hành:
Cứ sau 24 h lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tương ứng với 3 eppendorf cho mỗi ngày và tiến hành kiểm tra khả năng tạo biofilm theo các bước sau:
- Dùng pipet hút dịch nuôi cấy ra 1 cách nhẹ nhàng (không làm vỡ màng) - Rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 500 μl nước cất. Quá trình này được lặp lại 2 lần.
- Cho 300 μl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf ở nhiệt độ
phòng
- Đợi 10 phút để cố định màng - Hút bỏ dung dịch tím tinh thể - Rửa bằng 500 μl nước cất, 2 lần
- Bổ sung 300 μl dung dịch acetic acid 33%
- Đảo trộn hỗn hợp này, pha lỗng tới hạn rồi đo OD ở bước sóng 570 nm.
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý và nồng độ cũng như loại PAH đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: Tiến hành như mục 2.2.3 ở các nhiệt độ
20 oC, 28 oC, 30 oC, 37 oC,45oC
- Khảo sát ảnh hưởng của pH: Chuẩn bị môi trường Gost với các dải pH, sử dụng dải pH: 6, 7, 8, 9, 10. Sử dụng hỗn hợp 50 ppm PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene). Tiến hành như mục 2.2.3
- Khảo sát ảnh hưởng của muối NaCl: Chuẩn bị mơi trường Gost có bổ sung các nồng độ NaCl khác nhau: 0 %, 1%, 1,5 %, 2 % và tiến hành như mục 2.2.3
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và loại PAH khác nhau: tiến hành như mục 2.2.3 nhưng sử dụng các PAH ở các nồng độ khác nhau
26
2.2.6. Đánh giá khảnăng phân hủy PAH của màng sinh học (biofilm) do các
chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành 2.2.6.1. Quy trình tạo biofilm đa chủng
Bước 1: Từ các chủng vi khuẩn lựa chọn sinh khối của chúng được nhân lên
trong 50 ml môi trường LB dịch trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở 30 oC trong 24 giờ.
Bước 2: Sau 24 giờ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút/4 oC trong 10 phút để
thu sinh khối. Rửa bằng nước cất 2 lần.
Bước 3: Hòa tan sinh khối bằng nước cất, đo OD ở bước song 600nm và tính
tốn sao cho OD600 = 0,3. Bổ sung 100ml môi trường LB dịch vào bình trụ thủy
tinh.
Bước 4: Để tĩnh trong 24 giờ sao cho trên bề mặt bình thủy tinh xuất hiện lớp
màng vi sinh vật.
Bước 5: Dùng pipet hút nhẹ dịch ở dưới màng và rửa sạch màng bằng nước
cất 2 lần.
Bước 6: Bổ sung 100ml Gost dịch, bổ sung 0,5% glucose; 0,1% vitamin và
các loại PAH vào mỗi bình.
Bước 7: Nuôi tĩnh 9-14 ngày mang mẫu đi phân tích để đánh giá hiệu quả xử lý các thành phần trên.
2.2.6.2. Đánh giá khảnăng phân hủy các thành phần hydrocacbon thơm bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ. bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ.
• Qui trình chuẩn bị mẫu để phân tích PAH trong nước trên cơ sở phương pháp US EPA method 610
- Lấy 60 ml CH2Cl2 cho vào 500ml mẫu nước đựng trong phễu chiết, lắc
đều, để lắng chờ hỗn hợp tách thành hai pha. Tách pha CH2Cl2 (bên dưới) ra.
- Tiếp tục thêm 60 ml CH2Cl2 vào pha nước, làm tương tự như trên. (chiết 3 lần)
- Gom toàn bộ dịch chiết CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4, lọc, cô quay dung môi dưới áp suất giảm đến khi còn 10 ml.
27
- Cho dịch chiết này qua cột chiết pha rắn florisil, rửa giải bằng 3ml n-hexan - Hút 1ml dịch n-hexan đi phân tích GC/MS. Bơm 0.2µl mẫu vào máy GC/MS
Máy phân tích thuộc hệ GC/MS Agilent 6980-5973N. Cột sử dụng phân tích là HP-5MS. Chương trình nhiệt độ 50 - (3/ph) - 80- (8/ph) - 200 (15/ph) - 250 (7ph).
• Nguyên lý hoạt động của máy GC-MS:
Các Mẫu được được bơm vào cổng bơm sau đó được đưa đến buồng hố khí
(Mẫu lỏng hố thành dạng khí dưới áp suất thấp (10-4 – 10-7mmHg) nhờ bơm hút
chân không. Dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên(chất tẩm bên trong cột), có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh(khí mang, Helium) gọi là pha động. do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.Sau khi các cấu tử tách ra khỏi nhau sẽ lần
lượt đi vào buồng ion hóa qua một lỗ nhỏ có đường kính 0,013 – 0,05mm (bằng
vàng), dịng phân tử khí của mẫu va chạm với dòng electron mang năng lượng cao làm các phân tử mẫu trung hoà bị bật ra các electron và phá vỡ phân tử thành các mảnh ion dương, mảnh gốc hay phân tử trung hoà nhỏ. Các mảnh ion hình thành có
khối lượng m và điện tích e. sau đó chúng được gia tốc ở trong ống tứ cực và
chuyển động đến va đập vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu
điện. Tín hiệu này được khuyếch đại rồi chuyển sang bộ ghi. Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả. Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic. Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng (định tính) cho chất cần tách.Cịn diện tích pic là thước đo định lượng cho chất cần phân tích.
28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên mơi trường chứa PAH môi trường chứa PAH
Phân hủy sinh học các hợp chất vịng thơm có thể diễn ra theo hai cơ chế đồng trao đổi chất và cơ chế sử dụng các hợp chất vòng thơm là nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Ở cơ chế đồng trao đổi chất việc bổ sung nguồn carbon dễ hấp thụ đối với vi sinh vật giúp sẽ chúng sinh trưởng, phát triển tốt đồng thời tăng khả năng phân hủy sinh học của các hợp chất vòng thơm. [19]
Trong nghiên cứu này từ mẫu ban đầu được lấy từ các vị trí ơ nhiễm dầu, để
làm gia tăng số lượng vi sinh vật sử dụng các hợp chất vịng thơm, chúng tơi tiến
hành làm giàu mẫu trên mơi trường muối khống Gost có bổ sung 0,1% vitamin và 50ppm PAH, khơng có và có glucose với nồng độ là 0,5%.
Sau 3 lần làm giàu, màu sắc và độ đục của môi trường thay đổi rõ rệt so với nguồn mẫu nước thải ban đầu. So với lần làm giàu thứ nhất, lần làm giàu thứ 2 và thứ 3 chúng tôi quan sát thấy sau 24h nuôi lắc, màu môi trường thay đổi rõ rệt và sinh khối ngày càng tăng lên điều đó cho thấy phần nào sự phát triển nhanh chóng của
các vi sinh vật trong mẫu nước thải. Dịch làm giàu có bổ sung glucose có độ đục
dịch ni cũng như sinh khối bám trên thành bình nhiều hơn so với các dịch làm giàu không bổ sung glucose tương ứng (Hình 3.1).
Mẫu ban đầu Lần 1 Lần 2 Lần 3
29
Mẫu ban đầu Lần 1 Lần 2 Lần 3
(B)
Hình 3. 1. Mẫu làm giàu vsv trên nguồn cơ chất PAH (A), hỗn hợp PAH và
glucose(B)
Các mẫu làm giàu lần được tiến hành pha loãng tới hạn và cấy gạt trên mơi
trường Gost có chứa PAH sau 24 giờ thu được tập đoàn vi sinh vật, kết quả được
thể hiện ở hình 3.2.
(A)
(B)
Hình 3. 2. Tập đồn vi sinh vật trên mơi trường khống Gost và PAH: không chứa
glucose (A), có chứa glucose (B).
Chúng tơi nhận thấy rằng tập đồn vi sinh vật ở những bình làm giàu có chứa
30
qua đó phần nào khẳng định được các chủng vi sinh vật này đã sử dụng PAH theo cơ chế đồng trao đổi chất. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc cân đối các
nguồn dinh dưỡng để hiệu quả xử lý là tốt nhất. Sau khi tiến hành tách riêng, làm sạch và quan sát đặc điểm khuẩn lạc, có 24 chủng vi khuẩn đã được phân lập.
Để tuyển chọn được các chủng có khả năng sử dụng PAH tốt nhất trong các
chủng trên em đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng PAH của từng chủng trên mơi trường muối khống Gost dịch (20 ml) có bổ sung 50 ppm hỗn hợp PAH, 0,5%
glucose 0,1% vitamin, nuôi lắc ở điều kiện 30oC trong 7 ngày. Khả năng sử dụng
PAH được đánh giá định tính thơng qua độ đục của mơi trường và lượng sinh khối bám trên thành bình. Kết quả sàng lọc đã nhận được 10 chủng vi khuẩn có khảnăng
sử dụng PAH mạnh nhất (Bảng 3.1).
Bảng 3. 1: Hình thái khuẩn lạc của 10 chủng vi khuẩn đã sàng lọc được.
TT Kí hiệu
chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
1 B2 Khuẩn lạc màu trắng trong, khi già có màu vàng nghệ, nhăn mép, có nhân ở giữa màu nâu khi cịn non d-2mm
2 B5 Khuẩn lạc mầu hồng trịn dẹt, to, có nhân ở giữa, ăn sâu vào thạch d-3mm
3 B8 Khuẩn lạc màu vàng nhạt, trịn căng, bóng nhơ lên ở giữa d-2mm 4 B10 Khuẩn lạc màu vàng, già chuyển thành màu hồng đỏ, trịn, bóng,
d-1mm
5 B16 Khuẩn lạc màu trắng trong, trịn căng bóng, ăn sâu vào bề mặt thạch d-2mm
6 B11 Khuẩn lạc trịn, khơ cằn, màu vàng nghệ, bám nơng trên bề mặt thạch d-2mm
7 B17 Khuẩn lạc trịn, lồi, ướt, màu vàng nghệ, đường kính 1,5-2 mm 8 B21 Khuẩn lạc trịn, bóng ướt, màu trắng trong có nhân d-2,0mm 9 B23 Khuẩn lạc màu trắng trong, trịn, bóng ướt, d-3 mm 10 B24 Khuẩn lạc to, trịn bóng ướt, màu xanh rêu có nhân d-2mm
31
3.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khảnăng tạo màng sinh học (biofilm) từ các chủng đã lựa chọn chủng đã lựa chọn
Để đánh giá khả năng tạo màng của 10 chủng vi khuẩn đã phân lập và tuyển
chọn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự dựa trên nguyên lý về khả năng bắt giữ tím tinh thể của thành tế bào vi khuẩn (mục 2.2.4). Các chủng này với độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm bằng 0,3 được nuôi cấy trên môi trường MPA dịch trong điều kiện tĩnh, ở 30oC, sau 24 h màng sinh học được hình thành, chúng tơi tiến hành rửa màng bằng nước cất cho sạch môi
trường nuôi cấy, và nhuộm màng bằng tím tinh thể kết quả được thể hiện ở hình 3.3
Hình 3. 3.Biofilm của 10 vi khuẩn tuyển chọn tạo thành sau 24 h nuôi cấy được nhuộm với dung dịch tím tinh thể 0,1%
Quan sát lượng tím tinh thể bám trên thành ống effendorf ở hình 3.3, chúng tơi nhận thấy khả năng bắt giữ tím tinh thể của biofilm do các chủng B11, B17,
B21, B23, B24 tạo thành tốt hơn so với 5 chủng còn lại.
Phương pháp nhuộm tím tinh thể giúp phát hiện ra các tế bào bám dính trong
một biofilm trên bề mặt vật thể đồng thời cũng cho phép định lượng mức độ hình thành biofilm mạnh hay yếu trong một khoảng thời gian nhất định bằng phương
pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm (OD 570). Màng sinh học sau khi
cố định được tím tinh thể, sẽ được hịa tan trong dung dịch axít acetic và pha lỗng tới hạn rồi đo mật độ quang phổ ở bước sóng 570 nm, kết quả được thể hiện ở hình 3.4 như sau:
32
Hình 3. 4. Đồ thị mật độ quang phổ đánh giá khả năng hình thành biofilm
Từ kết quả trên có thể thấy trong 10 chủng vi khuẩn được lựa chọn thì 5 chủng B11, B17, B21, B23, B24 đều có giá trị OD 570 khá cao từ 5,9 – 22,68. Trong
đó, chủng B17 có khả năng hình thành biofilm mạnh nhất, tiếp đến là các chủng
B11, B21 B23, và B24. Như vậy 5 chủng vi khuẩn này có khả năng sử dụng PAH cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng, đồng thời khả năng hình thành
biofilm cao nhất. Vì vậy chúng tơi đã lựa chọn 5 chủng này là những chủng đại diện
để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Năm chủng vi khuẩn này đã được tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (Bảng 3.2) và phân loại dựa vào trình
tự gen mã hóa 16S rRNA, chúng đã được định tên và đăng ký trên NCBI (Bảng
3.3). 0 5 10 15 20 25 B2 B5 B8 B10 B16 B11 B17 B21 B23 B24 OD 570 Kí hiệu chủng vi khuẩn
Sau 1 ngày nuôi cấy Sau 2 ngày nuôi cấy
33
Bảng 3. 2: Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của 5 chủng vi khuẩn được lựa
chọn
Thứ tự Ký hiệu Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào
1 B11
2 B17
3 B21
4 B23
34
Bảng 3. 3: Kết quả phân loại và định tên của 5 chủng vi khuẩn lựa chọn
Thứ tự Ký hiệu chủng Tên phân loại Mã số trên NCBI
1 B11 Rhodococcus sp. B11 KC151262
2 B17 Rhodococcus sp. B17 JQ073891
3 B21 Pseudomonas sp. BQN21 KC151263
4 B23 Alcaligenes sp. BQN23 KC191600
5 B24 Pseudomonas sp. BQN24 KC178570
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một sốđiều kiện hóa lý và nồng độcũng như các loại PAH đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn
Hiệu quả phân hủy PAH phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố tuy nhiên yếu tố ảnh
hưởng lớn nhất trực tiếp nhất đến khả năng phân hủy cũng như sinh trưởng phát
triển của vi sinh vật là nhiệt độ, pH, nồng độ muối và khả năng sử dụng các nguồn carbon. Chính vì vậy để xác định được các điều kiện tối ưu của những yếu tố trên,
chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi
khuẩn này ởcác điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau, khảnăng sinh trưởng trên một số loại PAH ở các nồng độ khác nhau.
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Mỗi chủng vi sinh vật đều phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất định.
Ngồi khoảng nhiệt độ đó ra chúng sẽ bị hạn chế sự phát triển, chính vì vậy đây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sư sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật.
Đối với nhiệt độ thấp thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó tác động
lên khả năng chuyển hóa các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các hệ enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất, vì thế làm vi sinh vật mất khả năng phát triển