TT Kí hiệu
chủng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
1 B2 Khuẩn lạc màu trắng trong, khi già có màu vàng nghệ, nhăn mép, có nhân ở giữa màu nâu khi còn non d-2mm
2 B5 Khuẩn lạc mầu hồng tròn dẹt, to, có nhân ở giữa, ăn sâu vào thạch d-3mm
3 B8 Khuẩn lạc màu vàng nhạt, trịn căng, bóng nhơ lên ở giữa d-2mm 4 B10 Khuẩn lạc màu vàng, già chuyển thành màu hồng đỏ, trịn, bóng,
d-1mm
5 B16 Khuẩn lạc màu trắng trong, trịn căng bóng, ăn sâu vào bề mặt thạch d-2mm
6 B11 Khuẩn lạc trịn, khơ cằn, màu vàng nghệ, bám nông trên bề mặt thạch d-2mm
7 B17 Khuẩn lạc tròn, lồi, ướt, màu vàng nghệ, đường kính 1,5-2 mm 8 B21 Khuẩn lạc trịn, bóng ướt, màu trắng trong có nhân d-2,0mm 9 B23 Khuẩn lạc màu trắng trong, trịn, bóng ướt, d-3 mm 10 B24 Khuẩn lạc to, trịn bóng ướt, màu xanh rêu có nhân d-2mm
31
3.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khảnăng tạo màng sinh học (biofilm) từ các chủng đã lựa chọn chủng đã lựa chọn
Để đánh giá khả năng tạo màng của 10 chủng vi khuẩn đã phân lập và tuyển
chọn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự dựa trên nguyên lý về khả năng bắt giữ tím tinh thể của thành tế bào vi khuẩn (mục 2.2.4). Các chủng này với độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm bằng 0,3 được ni cấy trên môi trường MPA dịch trong điều kiện tĩnh, ở 30oC, sau 24 h màng sinh học được hình thành, chúng tơi tiến hành rửa màng bằng nước cất cho sạch môi
trường nuôi cấy, và nhuộm màng bằng tím tinh thể kết quả được thể hiện ở hình 3.3
Hình 3. 3.Biofilm của 10 vi khuẩn tuyển chọn tạo thành sau 24 h nuôi cấy được nhuộm với dung dịch tím tinh thể 0,1%
Quan sát lượng tím tinh thể bám trên thành ống effendorf ở hình 3.3, chúng tơi nhận thấy khả năng bắt giữ tím tinh thể của biofilm do các chủng B11, B17,
B21, B23, B24 tạo thành tốt hơn so với 5 chủng cịn lại.
Phương pháp nhuộm tím tinh thể giúp phát hiện ra các tế bào bám dính trong
một biofilm trên bề mặt vật thể đồng thời cũng cho phép định lượng mức độ hình thành biofilm mạnh hay yếu trong một khoảng thời gian nhất định bằng phương
pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm (OD 570). Màng sinh học sau khi
cố định được tím tinh thể, sẽ được hịa tan trong dung dịch axít acetic và pha lỗng tới hạn rồi đo mật độ quang phổ ở bước sóng 570 nm, kết quả được thể hiện ở hình 3.4 như sau:
32
Hình 3. 4. Đồ thị mật độ quang phổ đánh giá khả năng hình thành biofilm
Từ kết quả trên có thể thấy trong 10 chủng vi khuẩn được lựa chọn thì 5 chủng B11, B17, B21, B23, B24 đều có giá trị OD 570 khá cao từ 5,9 – 22,68. Trong
đó, chủng B17 có khả năng hình thành biofilm mạnh nhất, tiếp đến là các chủng
B11, B21 B23, và B24. Như vậy 5 chủng vi khuẩn này có khả năng sử dụng PAH cho q trình sinh trưởng và phát triển của chúng, đồng thời khả năng hình thành
biofilm cao nhất. Vì vậy chúng tôi đã lựa chọn 5 chủng này là những chủng đại diện
để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Năm chủng vi khuẩn này đã được tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (Bảng 3.2) và phân loại dựa vào trình
tự gen mã hóa 16S rRNA, chúng đã được định tên và đăng ký trên NCBI (Bảng
3.3). 0 5 10 15 20 25 B2 B5 B8 B10 B16 B11 B17 B21 B23 B24 OD 570 Kí hiệu chủng vi khuẩn
Sau 1 ngày ni cấy Sau 2 ngày ni cấy
33
Bảng 3. 2: Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của 5 chủng vi khuẩn được lựa
chọn
Thứ tự Ký hiệu Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào
1 B11
2 B17
3 B21
4 B23
34