1. Những phương phâp cơ bản trong phịng thí nghiệm
Những phương phâp cơ bản trong phịng thí nghiệm giúp đânh giâ tình trạng sức khỏe tơm ni vă phân đôn những ngun nhđn có thể gđy bùng nổ bệnh. Có khi việc chẩn đơn chính xâc có thể được thực hiện chỉ trong một thời gian ngắn. Những phương phâp năy có thể được thực hiện ngay tại trại ni tơm hay chỉ cần có kính hiển vi vă câc dụng cụ tiểu phẩu đơn giản lă có thể thực hiện được.
a. Kính phết huyết tương dùng để kiểm tra hình thâi của hồng cầu vă sự hiện diện của vi khuẩn vă ký sinh trùng trong mâu. Những biến đổi như nhđn bị co lại thường có liín quan đến bệnh Vibrio hoặc bệnh đầu văng. Nhđn bị vỡ vă có nhiều thể vùi trong tế băo chất lă biểu hiện đặc trưng của sự nhiễm virus gđy bệnh đầu văng (yellow head virus - YHV). Tuy nhiín sự vắng mặt của thể ẩn cũng khơng loại trừ trường hợp tôm bị nhiễm virus. Vi khuẩn Vibrio thường phổ biến trong câc trường hợp nhiễm khuẩn. Vi băo tử trùng (Microsporidium)
cũng thường được tìm thấy trong mâu. Có thể nhuộm mẫu huyết tương bằng phương phâp nhuộm Gram, nhuộm Wright hay nhuộm Heamatoxyline & Eosin (H&E)
b. Cố định mang tôm bằng dung dịch HCl Davidson vă nhuộm bằng thuốc
nhuộm H&E có thể phât hiện virus gđy bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus - WSSV), YHV vă virus gđy hoại tử cơ quan tạo mâu vă cơ quan lập biểu mô (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus - IHHNV). Vi khuẩn gđy bệnh đóng rong, ngun sinh động vật, nấm mycosis vă hiện tượng tiết hắc tố cũng được phât hiện bằng câch năy
c. Quan sât tiíu bản tươi bằng câch lấy mẫu của mang, phụ bộ hay bất kỳ bộ phận năo cần quan sât mă không lăm chết tôm cho văo một giọt dung dịch 2.8% NaCl hoặc nước biển vô trùng, đậy bằng lam vă quan sât dưới kính hiển vi để phât hiện vi khuẩn dạng sợi, ngun sinh động vật, vi khuẩn hình que có khả năng di động (thường lă nhóm Vibrio), nấm mycosis, diatom, tảo lục vă cả mùn bả hữu cơ. Ở những chổ bị đen dưới vỏ hoặc trong cơ có thể dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu vă đặt mẫu lín phiến kính với một giọt dung dịch 2.8% NaCl vă quan sât dưới kính hiển vi để phât hiện vi khuẩn gđy bẩn, nguyín sinh động vật vă nấm Furasium.
2. Phương phâp phđn lập vă định danh vi khuẩn
Đối với nhóm vi khuẩn gđy bẩn: việc xâc định vi khuẩn gđy bẩn khơng địi hỏi đến thao tâc ni cấy mă chỉ cần quan sât tiíu bản tươi câc phụ bộ tơm dưới kính hiển vi hay bằng phương thức mô học. Việc định danh đến mức loăi thường khơng cần thiết vì chúng khơng liín quan đến khả năng gđy bệnh của nhóm vi khuẩn năy. Vi khuẩn gđy bẩn thường được dùng như lă câc chỉ thị về chất lượng nước kĩm vă tình trạng sức khoẻ tôm không tốt.
Trường hợp vi khuẩn Vibrio thường địi hỏi thao tâc phđn lập vă ni cấy trín mơi trường chọn lọc TCBS. Nhóm vi khuẩn Vibrio phât quang cịn được phđn lập trín một trường phât quang. Có rất nhiều phương phâp hiện hănh được sử dụng để định danh vi khuẩn Vibrio đến mức loăi (PCR, RFLP, AFLP…) hoặc định typ (multiplex PCR, lai ADN…) để nghiín cứu dịch tể của bệnh do nhóm Vibrio gđy ra. Tuy nhiín phương phâp định danh bằng câc phản ứng sinh hô truyền thống vẫn cịn có giâ trị nhất định nhằm xâc định một số chỉ tiíu sinh lý, sinh hô của câc dịng vi khuần Vibrio phđn lập từ tôm bệnh.
3. Phương phâp mô học
Phương phâp mơ học nghiín cứu cấu trúc mơ ở mức độ hiển vi vă mô bệnh học lă một chun mơn hẹp của phương thức mơ học đề cập tới q trình phât triển bệnh. Mơ bệnh học lă một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiín cứu bệnh tơm vă nhiều
trường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đôn được bằng phương phâp năy. Tuy nhiín,
phương phâp năy cũng có những hạn chế, chẳng hạn, thao tâc tương đối chậm mă
trong nhiều trường hợp bệnh tơm cần phải được xử lý ngay trước khi có được kết quả xĩt nghiệm mô học. Phương thức mô học chỉ nín sử dụng kết hợp với tất cả câc dữ liệu về môi trường vă sức khỏe tôm để xâc định tâc nhđn gđy bệnh
Trước khi quan sât dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để trânh bị hư thối, loại bỏ thức ăn vă đúc khối sâp. Cắt mẫu thănh từng lât mỏng khoảng 3-4 mm, rồi đặt lín lam, nhuộm mău vă đậy bằng lam kính. Thịt tơm bị phđn hủy cực kỳ nhanh sau khi tơm chết, vì thế cần phải cố định chúng. Tôm chết dù được giữ trong nước đâ hay đơng lạnh đều cũng vơ ích đối với phương phâp mô học do những biến đổi xảy ra trong cơ. Dung dịch cố định tôm tốt nhất lă Davidson vă formaline đệm trung tính.
4. Phương phâp tạo phản ứng chuỗi nhờ polymerase (PCR)
Nguyín tắc của phương phâp PCR
Tất cả câc ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyín biệt. Mồi lă những đoạn
ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, vă ADN
polymerase sẽ nối dăi mồi để hình thănh mạch mới. Phương phâp PCR đê được hình thănh dựa văo đặc tính đó của câc ADN polymerase. Nếu cung cấp hai mồi chuyín biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa lă để khuếch đại một trình tự ADN xâc định, ta phải có thơng tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo câc mồi bổ sung chun biệt.
Câc hạn chế của phương phâp PCR
Do độ nhạy rất cao của phương phâp PCR đồng thời với thao tâc rất đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương phâp năy để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiín, ta khơng thể qn rằng phương phâp có nhiều mặt hạn chế vă địi hỏi sự thận trọng, đặc biệt khi tiến hănh thí nghiệm cũng như khi phđn tích kết quả. Có thể kể đến ba vấn đề lớn khi sử dụng phương phâp PCR:
- Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại lă giới hạn đầu tiín: trừ văi trường hợp rất câ biệt, phương phâp PCR không hoạt động
được với những đoạn ADN lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với câc độ dăi dưới 1.5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dăi lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xâc định qua thực nghiệm.
- Sự ngoại nhiễm: lă vấn đề lớn nhất đặt ra đối với phương phâp PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương phâp năy. Đđy lă vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoân, dự phịng vì hậu quả có thể rất nghiím trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường lă câc sản
phẩm khuếch đại của những lần thao tâc trước. Người ta đê chứng minh được rằng việc mở nắp câc ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng khơng gian kín như phịng thí nghiệm sẽ khiến cho câc phđn tử đê được khuếch đại thoât ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong khơng khí vă bâm văo tường, cửa, thiết bị, dụng cụ... rồi nhiễm văo câc phản ứng tiến hănh sau đó.
- Câc sai sót gđy ra do taq polymerase: sự sao chĩp bởi taq polymerase cho
tỉ lệ sai khâ cao (10-4, nghĩa lă cứ 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính năy khơng nghiím trọng nếu ta chỉ cần xem xĩt kích
thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại. Nhưng có ý nghĩa lớn
nếu cần xâc định chính xâc trình tự nucleotic của ADN ta không thể loại bỏ hoăn toăn câc sai sót năy mă chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cđn bằng nồng độ câc nucleotic trong phản ứng, xâc định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tâc riíng biệt, so sânh trước khi đi đến trình tự chính thức, vv.
Tăi liệu tham khảo
1. Hảo, N.V., 2000. Một số vấn đề về kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp. Nhă xuất bản nông nghiệp TPHCM
2. Lightner, D.V. 1996. (Ed.), A handbook of shrimp pathology and diagnostic. Procedures for disease of cultured Penaeid shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA.
3. Manual of diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2003. http://www.oie.int 4. Nho, N.T., N.A. Tuấn, T.K. Thường, 1994. Hướng dẫn kỹ thuật nuôi tôm sú. 5. Quản lý sức khỏe ao nuôi tôm. Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ dịch. 2002 6. Sindermann C.J. and D.V. Lightner. 1988. Disease Diagnosis and Control in
North American Aquaculture. Elservier Scientific Publisher. 431p.
7. Tower, K.J. and A. Cockayne (1993). Molecular Method for Microbial Identification and Typing. Chapman & Hall, London.