Chất R Số sóng ứng với các dao động (cm-1) νC=O νC-N νN-H νC-H (sp3) νC-X Va 3-Cl 1664 1290 3358 3053 1072 Vb 4-Cl 1672 1277 3348 3061 1091 Vc 3-F 1685 1279 3280 3116 1219 Vd 4-F 1666 1281 3261 3059 1215
Ghi chú: ν là dao động hóa trị
Nhận xét: Dựa vào bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1-4) có thể sơ bộ nhận ra sự hiện diện của các nhóm chức thơng qua vị trí, cƣờng độ và hình dạng pic ví dụ nhƣ dao động của liên kết C=O của amid, liên kết C-N, C-X và C-H của nhóm amin thơm.
34
3.1.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của các chất Va-d
Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1
H-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của các dẫn chất Va-d
Chất CTCT Số liệu phân tích 1H-NMR (500 MHz, CDCl3); (ppm) Va 8,08 (s, 1H, NH-CO); 7,99 (s, 1H, H-3); 7,53 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4); 7,52 (s, 1H, H2’); 7,26 (d, J = 6 Hz, 1H, H-6’); 7,19 (t, J = 8 Hz, 1H, H-5’); 7,06 (d, J = 8 Hz, 1H; H4’); 6,64 (dd, J = 8,5 Hz, J’ = 1,5 Hz, 1H, H-5); 6,56 (s, 1H, H-7); 5,01 (s, 2H, CH2); 3,98 (s, 2H, NH2). Vb 8,04 (s, 1H, NH-CO); 7,99 (s, 1H, H3); 7,53 (d, J = 9 Hz, 1H, H-4); 7,34 – 7,37 (m, 2H, H-2’); 7,22 – 7,26 (m, 2H, H-3’); 6,63 (dd, J = 8,5 Hz, J’ = 2 Hz, 1H, H-5); 6,56 (s, 1H, H-7) 5,01 (s, 2H, CH2). Vc 8,14 (s, 1H, NH-CO); 7,99 (s, 1H, H-3); 7,53 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4); 7,26 (s, 1H, H-2’); 7,18 – 7,22 ( m, 1H, H-5’); 7,02 (d, J = 8 Hz, 1H, H-6’); 6,77 – 7.80 (m, 1H, H-4’); 6,63 (dd, J = 8,5 Hz, J’ = 2 Hz, 1H, H-5); 6,57(s, 1H, H-7); 4,59 (s, 2H, CH2); 3,98 (s, 2H, NH2). Vd 7,99 (s, 1H, NH-CO); 7,95 (s, 1H, H3); 7,54 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4); 7,35-7,38 (m, 2H, H-2’); 6,95 - 6,98 (m, 2H, H-3’); 6,63 (dd, , J = 7,5 Hz, J’ = 2Hz, 1H, H5); 6,57 (s, 1H, H-7); 5,02 (s, 2H, CH2); 3,97 (s, 2H, NH2).
35
Ghi chú: : độ dịch chuyển hóa học (ppm); s: vạch đơn (singlet); d: vạch đôi
(doublet); t: vạch ba (triplet); dd: vạch chẻ đôi 2 lần (doublet of doublet).
Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích phổ ở bảng 3.5 và phổ đồ của các chất tổng
hợp đƣợc (phụ lục 9-12) có thể nhận thấy số lƣợng proton, độ dịch chuyển hóa học, độ bội của pic và các hằng số cộng hƣởng phù hợp với các proton trong công thức dự kiến của 4 chất Va-d.
3.1.2.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13
C-NMR của các chất Va-d
Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của các chất tổng hợp đƣợc trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các dẫn chất Va-d
STT Chất R Số liệu phân tích 13 C-NMR 1 Va 3-Cl 166,09; 147,07; 142,26; 138,17; 135,95; 134,60; 129,93; 124,77; 122,38, 120,10; 118,02; 117,83; 113,57; 91,19; 52,328 2 Vb 4-Cl 166,02; 147,05; 142,26; 135,91; 135,62; 129,73; 128,97; 121,29; 121,29; 117,82; 113,55; 91,20; 52,30 3 Vc 3-F 166,09; 147,08; 142,26; 138,50; 135,90; 130,05; 129,97; 122,36; 117,82; 113,57; 111,52; 91,23; 52,37 4 Vd 4-F 165,99; 147,02; 142,24; 135,86; 133,02; 132,99; 12235; 121,98; 117,84; 115,53; 113,53; 91,23; 52,27
Nhận xét: Dựa vào bảng 3.6 và phổ đồ của các chất tổng hợp đƣợc (phụ lục 13-
16) có thể thấy sự xuất hiện các pic và độ dịch chuyển hóa học phù hợp với các nguyên tử carbon trong công thức dự kiến của 4 chất Va-d.
3.2. THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ IDO1
Các dẫn chất Va-d tổng hợp đƣợc có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến ban đầu, đƣợc đánh giá hoạt tính ức chế IDO1 ở nồng độ 1,0 mmol và so sánh với kết quả của chất chứng dƣơng IDO5L. Kết quả đƣợc thể hiện bằng phần trăm ức chế IDO1 và đƣợc trình bày ở bảng 3.7.
36
Bảng 3.7. Kết quả thử ức chế IDO1 của Va-d
STT Chất CTCT % ức chế IDO1 1 Va 49% 2 Vb 100% 3 Vc 57% 4 Vd 65% 5 IDO5L 100% 6 Chứng âm (dung môi) 0% Nhận xét: Ở nồng độ 1,0 mmol, các dẫn chất tổng hợp đƣợc có khả năng ức chế
IDO1 trong khoảng từ 49% đến 100%. Đặc biệt, chất Vb có khả năng ức chế IDO1 cao nhất (100%), cao bằng chất chứng dƣơng IDO5L. Ba chất còn lại Va, Vc, Vd đều có hoạt tính thấp hơn so với chất chứng dƣơng (49 – 65%).
3.3. BÀN LUẬN
3.3.1. Các phản ứng tổng hợp hóa học
Các dẫn chất Va-d đƣợc tổng hợp thông qua các phản ứng: N-alkyl hóa, thủy
phân este, amid hóa và khử hóa nhóm nitro thơm. Cần tối ƣu hóa điều kiện và quy trình cho từng phản ứng để đạt đƣợc hiệu suất cao nhất.
Nhìn chung, cấu trúc các chất khơng q phức tạp, các phản ứng thực hiện nhìn chung khá đơn giản. Trong quy trình vẫn có sử dụng một số tác nhân có tính ăn mịn
37
cao nhƣ SOCl2, HCl đặc, NaOH rắn, do đó cần kiểm sốt chặt chẽ các điều kiện cũng nhƣ an tồn phịng thí nghiệm.
a. Tổng hợp chất trung gian số II – Phản ứng N-alkyl hóa
Cơ chế của phản ứng đƣợc trình bày nhƣ sau:
Sơ đồ 3.14. Cơ chế hình thành sản phẩm khi alkyl 6-nitro-1H-indazol
Do có tham gia liên hợp tạo vịng thơm, cặp electron tự do trên nguyên tử N1 của vịng indazol có tính ái nhân yếu vì vậy mà khó tham gia phản ứng trực tiếp với tác nhân alkyl hóa là một akyl halogenid. Tuy vậy, nguyên tử hydro của nhóm NH có tính acid yếu nên ta hồn tồn có thể sử dụng một base để hoạt hóa, tách nguyên tƣ hydro tạo chất trung gian là anion có tính ái nhân mạnh hơn. Ngồi ra, để làm tăng tốc độ
phản ứng, một lƣợng nhỏ KI đƣợc thêm vào giúp tạo thành dẫn xuất alkyl iodid là tác nhân alkyl hóa mạnh.
Theo lý thuyết của phản ứng, cả hai vị trí N1 và N2 đều có thể tham gia vào phản ứng. Tuy nghiên, sau nhiều lần khảo sát, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng có thể thu đƣợc chọn lọc đồng phân alkyl N1 bằng cách tăng thời gian hoạt hóa 6-nitro-1H- indazol trong K2CO3 từ 30 phút lên 2 giờ đồng thời điều chỉnh tỷ lệ cloro este khoảng 3 đƣơng lƣợng sẽ thu đƣợc gần nhƣ 100% đồng phân N1.
38
Chất III đƣợc tổng hợp từ chất II thông qua 2 phản ứng: phản ứng thủy phân ester trong mơi trƣờng kiềm NaOH và phản ứng acid hóa muối natri bằng dung dịch HCl để tạo acid.
Phản ứng thủy phân ester trong môi trƣờng kiềm cho sản phẩm là muối của acid carboxylic nên có ƣu điểm là phản ứng khơng thuận nghịch, xảy ra hoàn toàn, tốc độ phản ứng cao hơn khi sử dụng xúc tác acid, điều kiện phản ứng êm dịu. Cơ chế phản ứng đƣợc trình bày nhƣ sau:
Sơ đồ 3.15. Cơ chế thủy phân ester tạo acid
Để tăng tốc độ phản ứng thủy phân ester có thể tăng nhiệt độ phản ứng lên khoảng 40-45°C. Dung môi sử dụng trong phản ứng thủy phân này sử dụng là MeOH hoặc EtOH nhằm hòa tan ester II và cũng hịa tan đƣợc lƣợng NaOH thêm vào. Cũng có thể thay NaOH bằng KOH nhƣng giá thành KOH cao hơn, hiệu suất phản ứng cũng tƣơng đƣơng nên NaOH vẫn đƣợc ƣu tiên sử dụng trong nghiên cứu.
Sau phản ứng thủy phân, dung môi đƣợc loại đi, acid III dễ dàng đƣợc tạo thành bằng cách acid hóa muối natri vừa tạo đƣợc bằng dung dịch acid HCl 5%. Khung indazol có tính sơ nƣớc nên dễ dàng tủa lại trong nƣớc lạnh và thu đƣợc nhờ phƣơng pháp lọc. Không nên thêm quá dƣ HCl do trong phân tử chất III có nguyên tử N ở vị trí số 2 của vịng indazol có tính base yếu có khả năng tạo muối trong mơi trƣờng acid. Muối này tan đƣợc trong nƣớc nên làm giảm hiệu suất của cả quá trình.
c. Tổng hợp các dẫn chất trung gian IVa-e – Phản ứng amid hóa
Các phản ứng tổng hợp chất trung gian IVa-d đều có cơ sở lý thuyết tƣơng tự nhau, đó là phản ứng tạo amid giữa acid hữu cơ III và dẫn chất anilin mang nhóm thế mục tiêu.
39
Cơ chế phản ứng amid hóa đƣợc trình bày theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.16. Cơ chế amid hóa tạo các dẫn chất IVa-e
Hợp chất III là một acid carboxylic đã đƣợc chuyển thành một dẫn xuất hoạt
động mạnh hơn là clorid acid nhờ tác nhân SOCl2. Clorid acid là tác nhân acyl hóa mạnh sẽ phản ứng đƣợc với anilin mang nhóm thế mục tiêu để tạo amid tƣơng ứng.
Trên thực tế, có thể tiến hành phản ứng bằng cách tạo trƣớc acyl clorid nhờ SOCl2 sau đó mới thêm dẫn chất của anilin mang nhóm thế mục tiêu vào phản ứng với acyl clorid đã tạo thành. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu nhận thấy việc tiến hành one-pot cũng không làm thay đổi hiệu suất phản ứng, quá trình tiến hành và xử lý đơn giản và tiết kiệm hơn nhiều. Do vậy khi tiến hành thí nghiệm, nhóm nghiên cứu quyết định đi theo hƣớng one-pot.
Phản ứng xảy ra với hiệu suất cao, dễ xử lí và tinh chế. SOCl2 là tác nhân khá phổ biến, giá thành rẻ, tuy nhiên nó là chất lỏng dễ bay hơi, mùi sốc. Trong quá trình phản ứng, sản phẩm phụ của quá trình là SO2 và HCl, trong đó SO2 là chất khí có mùi khó chịu, do đó phản ứng cần đƣợc tiến hành trong tủ hút. Acid HCl sinh ra trong q trình phản ứng có thể phản ứng ngƣợc với các dẫn xuất anilin tạo muối amoni clorid làm giảm hiệu suất phản ứng. Để khắc phục điều này, một lƣợng vừa đủ TEA đƣợc thêm vào với vai trò là base hữu cơ giúp trung hòa acid HCl sinh ra.
Ngồi sử dụng tác nhân thionyl clorid, nhóm trƣớc đó cũng đã sử dụng một tác nhân tạo amid khác là EDC/HOBt. Tuy nhiên, sử dụng tác nhân này mặc dù cho hiệu suất tƣơng đƣơng nhƣng phản ứng có nhiều tạp chất, chi phí cao và thời gian phản ứng lâu.
40
d. Phản ứng khử hóa nhóm nitro tạo sản phẩm cuối
Đây là phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm bằng tác nhân SnCl2.2H2O/HCl. Nhóm nitro khi đƣợc khử bằng phƣơng pháp này thƣờng phải trải qua các trạng thái trung gian nhƣ hydroxylamin, oxim…trƣớc khi đƣợc khử về nhóm amino nên phản ứng có thể khơng hồn tồn và tạo nhiều tạp chất. Vì vậy cần tinh chế sản phẩm nhờ sắc ký lỏng.
Phản ứng sử dụng SnCl2.2H2O/HCl là tác nhân khử êm dịu, đƣợc tiến hành ở điều kiện khá đơn giản, xảy ra tốt và nhanh ở ngay điều kiện phòng. Tuy nhiên, khi xử lý phản ứng bằng cách thêm dần dung dịch Na2CO3 bão hòa vào dung dịch, tủa Sn(OH)2 tạo ra rất khó lọc nếu tiến hành lọc trên giấy lọc thơng thƣờng do bít tắc lỗ lọc rất nhanh. Chính vì vậy, để khắc phục hiện tƣợng này, nhóm nghiên cứu tiến hành lọc loại tủa dƣới áp suất giảm bằng phễu buchner có sử dụng celite làm chất trợ lọc, cách làm này giúp tiết kiệm thời gian lọc và tăng hiệu suất lọc lên khá nhiều. Sản phẩm cuối cùng thu đƣợc là một amin thơm có tính khử, dễ bị oxy hóa cho nên cần kiểm soát nhiệt độ khi thực hiện các thao tác xử lý và tinh chế.
3.3.2. Khẳng định cấu trúc
Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đã đƣợc khẳng định thông qua các phƣơng pháp phổ bao gồm phổ hồng ngoại IR, phổ khối lƣợng MS, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1
H-NMR và 13C-NMR.
a. Phổ hồng ngoại IR
Phổ hồng ngoại IR cho ta nhận dạng sơ bộ về sự tồn tại của các nhóm chức quan trọng nhƣ nhóm amin thơm, amid (CO-NH),… hay các liên kết thông qua dao động đặc trƣng của chúng (phụ lục 1 đến 4). Cụ thể:
- Trong khoảng 3458 – 3398 cm-1 có dao động hóa trị của liên kết N-H ở nhóm chức amin thơm. Dao động hóa trị của liên kết N-H amid xuất hiện ở tần số thấp hơn trong khoảng 3358 - 3261 cm-1.
- Trong khoảng 3116 - 3053 cm-1 có sự xuất hiện của dao động hóa trị liên kết C- H (sp3).
- Trong khoảng 1685 - 1664 cm-1 có sự xuất hiện rõ nét dao động hóa trị của liên kết C=O của nhóm chức amid.
41
- Dao động hóa trị của liên kết C-N amin xuất hiện ở khoảng 1290 - 1277 cm-1. Trong khi dao động của liên kết C-N amid xuất hiện với tần số lớn hơn ở khoảng 1361 - 1317 cm-1.
Nhƣ vậy, dữ liệu phổ IR nhận đƣợc phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của các dẫn chất Va-d. Tuy vậy, thông tin phổ IR vẫn chƣa thể cung cấp đầy đủ cơ sở để khẳng định cấu trúc của các chất do đó cần thêm dữ liệu của phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng tử hạt nhân. Dƣới đây là ví dụ phổ IR của hợp chất Va:
Hình 3.1. Phổ IR của chất Va
b. Phổ khối lượng
Kết quả phổ đồ của các dẫn chất Va-d cho thấy đều xuất hiện các pic ion có giá trị bằng [M+H]+ với cƣờng độ mạnh. Từ đó, sơ bộ ta có thể khẳng định các chất Va-d đã đƣợc tổng hợp có số khối nhƣ dự kiến.
42
Hình 3.2. Phổ MS của chất Va
Chất Va có cơng thức dự kiến là C15H13ClN4O tƣơng ứng với số khối là
300,0778 hoặc 302,0748 tùy theo đồng phân. Trên phổ đồ của MS của chất IVa, ta có thể thấy pic ion [M+H]+
có số khối 301,0589 với cƣờng độ mạnh nhất và các pic phân mảnh có cƣờng độ yếu hơn.
c. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
❖ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Dựa trên kết quả phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của các chất Va-d đo trong CDCl3 (phụ lục 9 - 12) và bảng 3.5 ta có thể nhận thấy:
+) Proton của nhóm amin có độ dịch chuyển trong khoảng từ 3,97 - 3,98 ppm, thể hiện bằng một pic đơn, tù.
+ Proton của nhóm methylen cầu nối có độ dịch chuyển khoảng 5,0 ppm thể hiện bằng một pic đơn.
+ Nguyên tử H ở vịng indazol ở vị trí số 3 có độ chuyển dịch hóa học nằm vào khoảng 7,95 – 7,99 ppm.
+ Nguyên tử H nhóm amid NH-CO đƣợc thể hiện trên phổ đồ là một pic đơn, tù, có độ dịch chuyển vào khoảng 7,99 – 8,14 ppm.
+ Các nguyên tử H cịn lại của vịng benzen và vịng indazol có độ chuyển dịch phân bố trong khoảng từ 6,5 ppm đến 7,5 ppm.
43
Dƣới đây là phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Va:
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của chất Va
d. Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (13
44
Trên phổ đồ 13C-NMR của các chất Va-d (phụ lục 13-16 và bảng 3.6) ta thấy đều có sự xuất hiện đầy đủ các pic carbon đặc trƣng với độ dịch chuyển phù hợp với công thức của các chất dự kiến. Dƣới đây là phổ cộng hƣởng từ carbon của chất Va:
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của chất Va
3.3.3. Thử hoạt tính ức chế IDO1
Các hợp chất mục tiêu đƣợc thử tác dụng ức chế IDO1 và đem so sánh với chất ức chế IDO1 điển hình là IDO5L. Nhìn chung tại nồng độ 1,0 mM, có thể nhận xét rằng cả 4 chất mục tiêu đều có khả năng ức chế IDO1 ở mức khá đến rất tốt, từ 49% đến 100%. Trong đó, hợp chất Vb có hoạt tính tốt nhất với kết quả phần trăm ức chế IDO1 ở nồng độ 1,0 mM là 100%.
Từ kết quả trên có thể thấy, với các nhóm thế cũng nhƣ vị trí nhóm thế khác nhau trên vịng benzen sẽ cho ra hoạt tính của các dẫn chất là khác nhau.
Với cùng một nhóm thế, khi nhóm thế halogen ở vị trí số 4 (para) sẽ cho hoạt tính ức chế cao hơn khi nhóm thế ở vị trí số 3 (meta). Kết quả rõ nhất khi so sánh hai hợp chất Va và Vb, dù có cùng nhóm thế halogen là cloro, nhƣng hợp chất Vb với
nhóm thế ở vị trí số 4 cho kết quả phần trăm ức chế là 100%, cao hơn rất nhiều so với hợp chất Va chỉ với 49% có nhóm thể ở vị trí số 3 trên vịng benzen. Tƣơng tự hai hợp chất Vc và Vd có cùng nhóm thế floro nhƣng ở vị trí khác nhau là số 3 và 4 trên vòng
45
thơm cũng cho khả năng ức chế IDO1 là khác nhau tƣơng ứng là 57% và 65%. Điều này phù hợp với nghiên cứu SAR của Qian năm 2016 khi đã khẳng định vai trò của