Quy trình tổng hợp chất Va

❖ Tiến hành phản ứng:

- Cân 100 mg (0,30 mmol-1,0 đƣơng lƣợng) chất IVa vào bình cầu đáy trịn dung tích 50 ml.

- Thêm vào bình cầu 340 mg SnCl2.2H2O (5 đƣơng lƣợng) và một lƣợng EA vừa đủ khoảng 10ml để hòa tan hỗn hợp.

- Thêm từ từ từng giọt HCl đậm đặc (4 giọt), khuấy đều trên máy khuấy từ trong 6 giờ.

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan = 1:1.

❖ Xử lý phản ứng:

- Sau khi phản ứng hoàn toàn, thêm từ từ từng giọt dung dịch Na2CO3 đậm đặc vào bình phản ứng đến pH = 10-11 để tủa hoàn toàn muối thiếc dƣới dạng Sn(OH)2.

- Tiếp theo, tồn bộ dịch trong bình phản ứng đƣợc lọc qua phễu lọc Buchner, sử dụng celite làm chất trợ lọc, rửa tủa bằng EA (3 lần x 15 ml). Thu lấy dịch lọc.

- Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và thu lấy pha hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4 khan. Sau đó đem cơ quay dƣới áp suất giảm để loại dung môi.

- Cắn thu đƣợc sau khi cô quay đƣợc tinh chế bằng cách sử dụng cột sắc kí lỏng với hệ pha động EA:n-hexan = 40:60.

- Dịch chạy sắc kí đƣợc đem đi cơ quay loại dung môi. Cắn đem sấy khô trong tủ sấy chân không ở 40°C, thu đƣợc chất số Va.

❖ Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn màu trắng hơi hồng. - Hiệu suất: 71%

- Nhiệt độ nóng chảy: 194,5 – 196,2°C

- Rf = 0,51 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR. Kết quả đƣợc trình bày cụ thể ở phần phụ lục.

b. Tổng hợp chất số Vb

Chất 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(3-clorophenyl)acetamid (Va) đƣợc tổng hợp từ dẫn chất trung gian IVb nhờ phản ứng khử nhóm nitro với tác nhân là SnCl2.2H2O/HCl trong mơi trƣờng EA đƣợc trình bày theo sơ đồ dƣới đây:

Sơ đồ 3.11. Quy trình tổng hợp dẫn chất số Vb

❖ Tiến hành phản ứng:

- Cân 100 mg (0,30 mmol-1,0 đƣơng lƣợng) chất IVb vào bình cầu đáy trịn dung tích 50 ml.

- Thêm vào bình cầu 340 mg SnCl2.2H2O (5 đƣơng lƣợng) và một lƣợng EA vừa đủ khoảng 10ml để hòa tan hỗn hợp.

- Thêm từng giọt HCl đậm đặc (4 giọt), khuấy trên máy khuấy từ trong 6 giờ. - Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan = 1:1.

❖ Xử lý phản ứng:

- Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và thu lấy pha hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4 khan. Sau đó đem cô quay dƣới áp suất giảm để loại dung môi.

- Cắn thu đƣợc sau khi cô quay đƣợc tinh chế bằng cách sử dụng cột sắc kí lỏng với hệ pha động EA:n-hexan = 40:60.

- Dịch chạy sắc kí đƣợc đem đi cơ quay loại dung mơi. Cắn đem sấy khô trong tủ sấy chân không ở 40°C, thu đƣợc chất số Vb.

❖ Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn màu trắng hồng - Hiệu suất: 69%

- Nhiệt độ nóng chảy: 195,5–196,9°C

- Rf = 0,50 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1).

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR. Kết quả đƣợc trình bày cụ thể ở phụ lục.

c. Tổng hợp chất số Vc

Chất 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(3-florophenyl)acetamid đƣợc tổng hợp từ chất trung gian IVc thông qua phản ứng khử nhóm nitro với tác nhân là SnCl2.2H2O/HCl trong mơi trƣờng EA đƣợc trình bày theo sơ đồ dƣới đây:

Sơ đồ 3.12. Quy trình tổng hợp dẫn chất số Vc

❖ Tiến hành phản ứng:

- Cân 95 mg (0,30 mmol-1,0 đƣơng lƣợng) chất IVc vào bình cầu đáy trịn dung tích 50 ml

- Thêm vào bình cầu 340 mg SnCl2.2H2O (5 đƣơng lƣợng) và một lƣợng EA vừa đủ khoảng 10ml để hòa tan hỗn hợp.

- Thêm từ từ từng giọt HCl đậm đặc (4 giọt), khuấy đều trên máy khuấy từ trong 6 giờ.

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan = 1:1.

❖ Xử lý phản ứng:

- Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và thu lấy pha hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4 khan. Sau đó đem cơ quay dƣới áp suất giảm để loại dung môi.

- Cắn thu đƣợc sau khi cô quay đƣợc tinh chế bằng cách sử dụng cột sắc kí lỏng với hệ pha động EA:n-hexan = 40:60.

- Dịch chạy sắc kí đƣợc đem đi cơ quay loại dung mơi. Cắn đem sấy khô trong tủ sấy chân không ở 40°C, thu đƣợc chất số Vc.

❖ Kết quả:

30 - Hiệu suất: 72%

- Nhiệt độ nóng chảy: 188,3 -189,7°C

- Rf = 0,48 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ MS, IR, 1H-NMR, 13C-NMR. Kết quả đƣợc trình bày cụ thể ở phần phụ lục.

d. Tổng hợp chất số Vd

Chất 2-(6-amino-1 H-indazol-1-yl)-N-(4-florophenyl)acetamid đƣợc tổng hợp từ chất trung gian IVd thông qua phản ứng khử nhóm nitro với tác nhân là SnCl2.2H2O/HCl trong môi trƣờng EA đƣợc thể hiện theo sơ đồ dƣới đây:

Sơ đồ 3.13. Quy trình tổng hợp dẫn chất số Vd

❖ Tiến hành phản ứng:

- Cân 95 mg (0,30 mmol-1,0 đƣơng lƣợng) chất IVd vào bình cầu đáy trịn dung tích 50 ml.

- Thêm vào bình cầu 340 mg SnCl2.2H2O (5 đƣơng lƣợng) và một lƣợng EA vừa đủ khoảng 10ml để hòa tan hỗn hợp.

- Thêm từ từ từng giọt HCl đậm đặc (4 giọt), khuấy đều trên máy khuấy từ trong 6 giờ.

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan = 1:1.

❖ Xử lý phản ứng:

- Sau khi phản ứng hoàn toàn, thêm từ từ từng giọt dung dịch Na2CO3 đậm đặc vào bình phản ứng đến pH = 10-11 để tủa hồn toàn muối thiếc dƣới dạng Sn(OH)2.

- Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và thu lấy pha hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4 khan. Sau đó đem cơ quay dƣới áp suất giảm để loại dung môi.

- Cắn thu đƣợc sau khi cô quay đƣợc tinh chế bằng cách sử dụng cột sắc kí lỏng với hệ pha động EA:n-hexan = 40:60.

- Dịch chạy sắc kí đƣợc đem đi cơ quay loại dung mơi. Cắn đem sấy khô trong tủ sấy chân không ở 40°C, thu đƣợc chất số Vd.

❖ Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn màu trắng hồng - Hiệu suất: 68%

- Nhiệt độ nóng chảy: 186,1 – 187,8°C

- Rf = 0,46 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR. Kết quả đƣợc trình bày cụ thể ở phụ lục.

 Hiệu suất tổng hợp và chỉ số lý hóa của các dẫn chất Va-e đƣợc trình bày trong bảng dƣới đây.

Bảng 3.1. Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp các chất Va-d

Chất R CTPT KLPT Màu H%

Va 3-Cl C15H13ClN4O 300,0778 Trắng hồng 71%

Vb 4-Cl C15H13ClN4O 300,0778 Trắng hồng 69%

Vc 3-F C15H13FN4O 284,1073 Trắng hồng 72%

Vd 4-F C15H13FN4O 284,1073 Trắng hồng 68%

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các chất mục tiêu sau khi đƣợc tổng hợp và tinh chế đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng hai phƣơng pháp đó là phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng TLC và phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy. Các kết quả về hệ số lƣu giữ Rf và nhiệt độ nóng chảy của các chất mục tiêu Va-d đƣợc trình bày ở bảng 3.2.

3.1.2.1. Sắc kí lớp mỏng

Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 Mesh, hệ dung môi sử dụng trong phƣơng pháp là EA:n-hexan tỷ lệ 1:1 tiến hành trong bình sắc kí đứng và quan sát kết quả dƣới ánh sáng tử ngoại có bƣớc

sóng 254 nm. Kết quả TLC cho thấy các sản phẩm đều cho vết tròn, gọn, rõ khơng có vết phụ.

3.1.2.2. Đo nhiệt độ nóng chảy

Các dẫn chất mục tiêu Va-d đều ở thể rắn, đƣợc tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo chuyên dụng. Kết quả cho thấy, các chất mục tiêu Va-d đều có nhiệt độ nóng chảy xác định, có khoảng dao động nhiệt độ hẹp từ 1-2°C.

Bảng 3.2. Giá tri Rf và nhiệt độ nóng chảy của các chất mục tiêu Va-d

Chất R Sắc kí lớp mỏng Nhiệt độ nóng chảy (°C) Pha động Rf Va 3-Cl EA:n-hexan = 1:1 0,51 194,5-196,2 Vb 4-Cl EA:n-hexan = 1:1 0,50 195,5-196,9 Vc 3-F EA:n-hexan = 1:1 0,48 188,3-189,7 Vd 4-F EA:n-hexan = 1:1 0,46 186,1-187,8

Các kết quả trên cho thấy tất cả các chất mục tiêu Va-d đều tinh khiết và đủ điều kiện để thực hiện các bƣớc khẳng định cấu trúc bằng các phƣơng pháp phổ.

3.1.3. Xác định cấu trúc

Để khẳng định cấu trúc các chất đã tổng hợp đƣợc, nhóm nghiên cứu tiến hành phân tích phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon (13

C-NMR) và phổ hồng ngoại IR. Dữ liệu phổ đƣợc trình bày trong các bảng dƣới đây.

3.1.3.1 Phố khối lƣợng phân giải cao (HRMS)

Các chất đƣợc ghi phổ khối lƣợng theo phƣơng pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy phổ khối lƣợng LTQ - Orbitrap hãng Thermo - Scientific (Mỹ) tại Khoa Hóa học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Phổ đồ đƣợc ghi ở Phụ lục 7-12. Kết quả phân tích phổ khối của các chất Va-d đƣợc trình bày trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Giá trị phổ MS của các chất mục tiêu Va-d

Dẫn chất R CTPT KLPT m/z

Va 3-Cl C15H13ClN4O 300,0778 301,0859 [M+H]+

Vb 4-Cl C15H13ClN4O 300,0778 301,0861 [M+H]+

Vc 3-F C15H13FN4O 284,1073 285,1153 [M+H]+

Vd 4-F C15H13FN4O 284,1073 285.1153 [M+H]+

3.1.3.2. Phổ hồng ngoại của các dẫn chất Va-e

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại IR của các dẫn chất đƣợc trình bày trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ IR của các chất Va-d

Chất R Số sóng ứng với các dao động (cm-1) νC=O νC-N νN-H νC-H (sp3) νC-X Va 3-Cl 1664 1290 3358 3053 1072 Vb 4-Cl 1672 1277 3348 3061 1091 Vc 3-F 1685 1279 3280 3116 1219 Vd 4-F 1666 1281 3261 3059 1215

Ghi chú: ν là dao động hóa trị

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1-4) có thể sơ bộ nhận ra sự hiện diện của các nhóm chức thơng qua vị trí, cƣờng độ và hình dạng pic ví dụ nhƣ dao động của liên kết C=O của amid, liên kết C-N, C-X và C-H của nhóm amin thơm.

3.1.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của các chất Va-d

Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1

H-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của các dẫn chất Va-d

Chất CTCT Số liệu phân tích 1H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm) Va 8,08 (s, 1H, NH-CO); 7,99 (s, 1H, H-3); 7,53 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4); 7,52 (s, 1H, H2’); 7,26 (d, J = 6 Hz, 1H, H-6’); 7,19 (t, J = 8 Hz, 1H, H-5’); 7,06 (d, J = 8 Hz, 1H; H4’); 6,64 (dd, J = 8,5 Hz, J’ = 1,5 Hz, 1H, H-5); 6,56 (s, 1H, H-7); 5,01 (s, 2H, CH2); 3,98 (s, 2H, NH2). Vb 8,04 (s, 1H, NH-CO); 7,99 (s, 1H, H3); 7,53 (d, J = 9 Hz, 1H, H-4); 7,34 – 7,37 (m, 2H, H-2’); 7,22 – 7,26 (m, 2H, H-3’); 6,63 (dd, J = 8,5 Hz, J’ = 2 Hz, 1H, H-5); 6,56 (s, 1H, H-7) 5,01 (s, 2H, CH2). Vc 8,14 (s, 1H, NH-CO); 7,99 (s, 1H, H-3); 7,53 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4); 7,26 (s, 1H, H-2’); 7,18 – 7,22 ( m, 1H, H-5’); 7,02 (d, J = 8 Hz, 1H, H-6’); 6,77 – 7.80 (m, 1H, H-4’); 6,63 (dd, J = 8,5 Hz, J’ = 2 Hz, 1H, H-5); 6,57(s, 1H, H-7); 4,59 (s, 2H, CH2); 3,98 (s, 2H, NH2). Vd 7,99 (s, 1H, NH-CO); 7,95 (s, 1H, H3); 7,54 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4); 7,35-7,38 (m, 2H, H-2’); 6,95 - 6,98 (m, 2H, H-3’); 6,63 (dd, , J = 7,5 Hz, J’ = 2Hz, 1H, H5); 6,57 (s, 1H, H-7); 5,02 (s, 2H, CH2); 3,97 (s, 2H, NH2).

Ghi chú: : độ dịch chuyển hóa học (ppm); s: vạch đơn (singlet); d: vạch đôi

(doublet); t: vạch ba (triplet); dd: vạch chẻ đôi 2 lần (doublet of doublet).

Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích phổ ở bảng 3.5 và phổ đồ của các chất tổng

hợp đƣợc (phụ lục 9-12) có thể nhận thấy số lƣợng proton, độ dịch chuyển hóa học, độ bội của pic và các hằng số cộng hƣởng phù hợp với các proton trong công thức dự kiến của 4 chất Va-d.

3.1.2.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13

C-NMR của các chất Va-d

Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của các chất tổng hợp đƣợc trình bày ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các dẫn chất Va-d

STT Chất R Số liệu phân tích 13 C-NMR 1 Va 3-Cl 166,09; 147,07; 142,26; 138,17; 135,95; 134,60; 129,93; 124,77; 122,38, 120,10; 118,02; 117,83; 113,57; 91,19; 52,328 2 Vb 4-Cl 166,02; 147,05; 142,26; 135,91; 135,62; 129,73; 128,97; 121,29; 121,29; 117,82; 113,55; 91,20; 52,30 3 Vc 3-F 166,09; 147,08; 142,26; 138,50; 135,90; 130,05; 129,97; 122,36; 117,82; 113,57; 111,52; 91,23; 52,37 4 Vd 4-F 165,99; 147,02; 142,24; 135,86; 133,02; 132,99; 12235; 121,98; 117,84; 115,53; 113,53; 91,23; 52,27

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.6 và phổ đồ của các chất tổng hợp đƣợc (phụ lục 13-

16) có thể thấy sự xuất hiện các pic và độ dịch chuyển hóa học phù hợp với các nguyên tử carbon trong công thức dự kiến của 4 chất Va-d.

3.2. THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ IDO1

Các dẫn chất Va-d tổng hợp đƣợc có cấu trúc đúng nhƣ dự kiến ban đầu, đƣợc đánh giá hoạt tính ức chế IDO1 ở nồng độ 1,0 mmol và so sánh với kết quả của chất chứng dƣơng IDO5L. Kết quả đƣợc thể hiện bằng phần trăm ức chế IDO1 và đƣợc trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả thử ức chế IDO1 của Va-d

STT Chất CTCT % ức chế IDO1 1 Va 49% 2 Vb 100% 3 Vc 57% 4 Vd 65% 5 IDO5L 100% 6 Chứng âm (dung môi) 0% Nhận xét: Ở nồng độ 1,0 mmol, các dẫn chất tổng hợp đƣợc có khả năng ức chế

IDO1 trong khoảng từ 49% đến 100%. Đặc biệt, chất Vb có khả năng ức chế IDO1 cao nhất (100%), cao bằng chất chứng dƣơng IDO5L. Ba chất còn lại Va, Vc, Vd đều có hoạt tính thấp hơn so với chất chứng dƣơng (49 – 65%).

3.3. BÀN LUẬN

3.3.1. Các phản ứng tổng hợp hóa học

Các dẫn chất Va-d đƣợc tổng hợp thông qua các phản ứng: N-alkyl hóa, thủy

phân este, amid hóa và khử hóa nhóm nitro thơm. Cần tối ƣu hóa điều kiện và quy trình cho từng phản ứng để đạt đƣợc hiệu suất cao nhất.

Nhìn chung, cấu trúc các chất khơng q phức tạp, các phản ứng thực hiện nhìn chung khá đơn giản. Trong quy trình vẫn có sử dụng một số tác nhân có tính ăn mịn

cao nhƣ SOCl2, HCl đặc, NaOH rắn, do đó cần kiểm sốt chặt chẽ các điều kiện cũng nhƣ an tồn phịng thí nghiệm.

a. Tổng hợp chất trung gian số II – Phản ứng N-alkyl hóa

Cơ chế của phản ứng đƣợc trình bày nhƣ sau:

Sơ đồ 3.14. Cơ chế hình thành sản phẩm khi alkyl 6-nitro-1H-indazol

Do có tham gia liên hợp tạo vịng thơm, cặp electron tự do trên nguyên tử N1 của vịng indazol có tính ái nhân yếu vì vậy mà khó tham gia phản ứng trực tiếp với tác nhân alkyl hóa là một akyl halogenid. Tuy vậy, nguyên tử hydro của nhóm NH có tính acid yếu nên ta hồn tồn có thể sử dụng một base để hoạt hóa, tách nguyên tƣ hydro tạo chất trung gian là anion có tính ái nhân mạnh hơn. Ngồi ra, để làm tăng tốc độ

phản ứng, một lƣợng nhỏ KI đƣợc thêm vào giúp tạo thành dẫn xuất alkyl iodid là tác nhân alkyl hóa mạnh.

Theo lý thuyết của phản ứng, cả hai vị trí N1 và N2 đều có thể tham gia vào phản ứng. Tuy nghiên, sau nhiều lần khảo sát, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng có thể thu

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU