Cơ chế thủy phân ester tạo acid

Một phần của tài liệu Tổng hợp và thử tác dụng ức chế indoleamin 2,3 dioxygenase 1 của một số dẫn chất acetamid mới mang khung 6 amino 1h indazol (Trang 48)

Để tăng tốc độ phản ứng thủy phân ester có thể tăng nhiệt độ phản ứng lên khoảng 40-45°C. Dung môi sử dụng trong phản ứng thủy phân này sử dụng là MeOH hoặc EtOH nhằm hòa tan ester II và cũng hịa tan đƣợc lƣợng NaOH thêm vào. Cũng có thể thay NaOH bằng KOH nhƣng giá thành KOH cao hơn, hiệu suất phản ứng cũng tƣơng đƣơng nên NaOH vẫn đƣợc ƣu tiên sử dụng trong nghiên cứu.

Sau phản ứng thủy phân, dung môi đƣợc loại đi, acid III dễ dàng đƣợc tạo thành bằng cách acid hóa muối natri vừa tạo đƣợc bằng dung dịch acid HCl 5%. Khung indazol có tính sơ nƣớc nên dễ dàng tủa lại trong nƣớc lạnh và thu đƣợc nhờ phƣơng pháp lọc. Không nên thêm quá dƣ HCl do trong phân tử chất III có nguyên tử N ở vị trí số 2 của vịng indazol có tính base yếu có khả năng tạo muối trong mơi trƣờng acid. Muối này tan đƣợc trong nƣớc nên làm giảm hiệu suất của cả quá trình.

c. Tổng hợp các dẫn chất trung gian IVa-e – Phản ứng amid hóa

Các phản ứng tổng hợp chất trung gian IVa-d đều có cơ sở lý thuyết tƣơng tự nhau, đó là phản ứng tạo amid giữa acid hữu cơ III và dẫn chất anilin mang nhóm thế mục tiêu.

39

Cơ chế phản ứng amid hóa đƣợc trình bày theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.16. Cơ chế amid hóa tạo các dẫn chất IVa-e

Hợp chất III là một acid carboxylic đã đƣợc chuyển thành một dẫn xuất hoạt

động mạnh hơn là clorid acid nhờ tác nhân SOCl2. Clorid acid là tác nhân acyl hóa mạnh sẽ phản ứng đƣợc với anilin mang nhóm thế mục tiêu để tạo amid tƣơng ứng.

Trên thực tế, có thể tiến hành phản ứng bằng cách tạo trƣớc acyl clorid nhờ SOCl2 sau đó mới thêm dẫn chất của anilin mang nhóm thế mục tiêu vào phản ứng với acyl clorid đã tạo thành. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu nhận thấy việc tiến hành one-pot cũng không làm thay đổi hiệu suất phản ứng, quá trình tiến hành và xử lý đơn giản và tiết kiệm hơn nhiều. Do vậy khi tiến hành thí nghiệm, nhóm nghiên cứu quyết định đi theo hƣớng one-pot.

Phản ứng xảy ra với hiệu suất cao, dễ xử lí và tinh chế. SOCl2 là tác nhân khá phổ biến, giá thành rẻ, tuy nhiên nó là chất lỏng dễ bay hơi, mùi sốc. Trong quá trình phản ứng, sản phẩm phụ của quá trình là SO2 và HCl, trong đó SO2 là chất khí có mùi khó chịu, do đó phản ứng cần đƣợc tiến hành trong tủ hút. Acid HCl sinh ra trong q trình phản ứng có thể phản ứng ngƣợc với các dẫn xuất anilin tạo muối amoni clorid làm giảm hiệu suất phản ứng. Để khắc phục điều này, một lƣợng vừa đủ TEA đƣợc thêm vào với vai trò là base hữu cơ giúp trung hòa acid HCl sinh ra.

Ngồi sử dụng tác nhân thionyl clorid, nhóm trƣớc đó cũng đã sử dụng một tác nhân tạo amid khác là EDC/HOBt. Tuy nhiên, sử dụng tác nhân này mặc dù cho hiệu suất tƣơng đƣơng nhƣng phản ứng có nhiều tạp chất, chi phí cao và thời gian phản ứng lâu.

40

d. Phản ứng khử hóa nhóm nitro tạo sản phẩm cuối

Đây là phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm bằng tác nhân SnCl2.2H2O/HCl. Nhóm nitro khi đƣợc khử bằng phƣơng pháp này thƣờng phải trải qua các trạng thái trung gian nhƣ hydroxylamin, oxim…trƣớc khi đƣợc khử về nhóm amino nên phản ứng có thể khơng hồn tồn và tạo nhiều tạp chất. Vì vậy cần tinh chế sản phẩm nhờ sắc ký lỏng.

Phản ứng sử dụng SnCl2.2H2O/HCl là tác nhân khử êm dịu, đƣợc tiến hành ở điều kiện khá đơn giản, xảy ra tốt và nhanh ở ngay điều kiện phòng. Tuy nhiên, khi xử lý phản ứng bằng cách thêm dần dung dịch Na2CO3 bão hòa vào dung dịch, tủa Sn(OH)2 tạo ra rất khó lọc nếu tiến hành lọc trên giấy lọc thơng thƣờng do bít tắc lỗ lọc rất nhanh. Chính vì vậy, để khắc phục hiện tƣợng này, nhóm nghiên cứu tiến hành lọc loại tủa dƣới áp suất giảm bằng phễu buchner có sử dụng celite làm chất trợ lọc, cách làm này giúp tiết kiệm thời gian lọc và tăng hiệu suất lọc lên khá nhiều. Sản phẩm cuối cùng thu đƣợc là một amin thơm có tính khử, dễ bị oxy hóa cho nên cần kiểm soát nhiệt độ khi thực hiện các thao tác xử lý và tinh chế.

3.3.2. Khẳng định cấu trúc

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đã đƣợc khẳng định thông qua các phƣơng pháp phổ bao gồm phổ hồng ngoại IR, phổ khối lƣợng MS, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1

H-NMR và 13C-NMR.

a. Phổ hồng ngoại IR

Phổ hồng ngoại IR cho ta nhận dạng sơ bộ về sự tồn tại của các nhóm chức quan trọng nhƣ nhóm amin thơm, amid (CO-NH),… hay các liên kết thông qua dao động đặc trƣng của chúng (phụ lục 1 đến 4). Cụ thể:

- Trong khoảng 3458 – 3398 cm-1 có dao động hóa trị của liên kết N-H ở nhóm chức amin thơm. Dao động hóa trị của liên kết N-H amid xuất hiện ở tần số thấp hơn trong khoảng 3358 - 3261 cm-1.

- Trong khoảng 3116 - 3053 cm-1 có sự xuất hiện của dao động hóa trị liên kết C- H (sp3).

- Trong khoảng 1685 - 1664 cm-1 có sự xuất hiện rõ nét dao động hóa trị của liên kết C=O của nhóm chức amid.

41

- Dao động hóa trị của liên kết C-N amin xuất hiện ở khoảng 1290 - 1277 cm-1. Trong khi dao động của liên kết C-N amid xuất hiện với tần số lớn hơn ở khoảng 1361 - 1317 cm-1.

Nhƣ vậy, dữ liệu phổ IR nhận đƣợc phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của các dẫn chất Va-d. Tuy vậy, thông tin phổ IR vẫn chƣa thể cung cấp đầy đủ cơ sở để khẳng định cấu trúc của các chất do đó cần thêm dữ liệu của phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng tử hạt nhân. Dƣới đây là ví dụ phổ IR của hợp chất Va:

Hình 3.1. Phổ IR của chất Va

b. Phổ khối lượng

Kết quả phổ đồ của các dẫn chất Va-d cho thấy đều xuất hiện các pic ion có giá trị bằng [M+H]+ với cƣờng độ mạnh. Từ đó, sơ bộ ta có thể khẳng định các chất Va-d đã đƣợc tổng hợp có số khối nhƣ dự kiến.

42

Hình 3.2. Phổ MS của chất Va

Chất Va có cơng thức dự kiến là C15H13ClN4O tƣơng ứng với số khối là

300,0778 hoặc 302,0748 tùy theo đồng phân. Trên phổ đồ của MS của chất IVa, ta có thể thấy pic ion [M+H]+

có số khối 301,0589 với cƣờng độ mạnh nhất và các pic phân mảnh có cƣờng độ yếu hơn.

c. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

❖ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Dựa trên kết quả phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của các chất Va-d đo trong CDCl3 (phụ lục 9 - 12) và bảng 3.5 ta có thể nhận thấy:

+) Proton của nhóm amin có độ dịch chuyển trong khoảng từ 3,97 - 3,98 ppm, thể hiện bằng một pic đơn, tù.

+ Proton của nhóm methylen cầu nối có độ dịch chuyển khoảng 5,0 ppm thể hiện bằng một pic đơn.

+ Nguyên tử H ở vịng indazol ở vị trí số 3 có độ chuyển dịch hóa học nằm vào khoảng 7,95 – 7,99 ppm.

+ Nguyên tử H nhóm amid NH-CO đƣợc thể hiện trên phổ đồ là một pic đơn, tù, có độ dịch chuyển vào khoảng 7,99 – 8,14 ppm.

+ Các nguyên tử H cịn lại của vịng benzen và vịng indazol có độ chuyển dịch phân bố trong khoảng từ 6,5 ppm đến 7,5 ppm.

43

Dƣới đây là phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất Va:

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của chất Va

d. Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (13

44

Trên phổ đồ 13C-NMR của các chất Va-d (phụ lục 13-16 và bảng 3.6) ta thấy đều có sự xuất hiện đầy đủ các pic carbon đặc trƣng với độ dịch chuyển phù hợp với công thức của các chất dự kiến. Dƣới đây là phổ cộng hƣởng từ carbon của chất Va:

Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của chất Va

3.3.3. Thử hoạt tính ức chế IDO1

Các hợp chất mục tiêu đƣợc thử tác dụng ức chế IDO1 và đem so sánh với chất ức chế IDO1 điển hình là IDO5L. Nhìn chung tại nồng độ 1,0 mM, có thể nhận xét rằng cả 4 chất mục tiêu đều có khả năng ức chế IDO1 ở mức khá đến rất tốt, từ 49% đến 100%. Trong đó, hợp chất Vb có hoạt tính tốt nhất với kết quả phần trăm ức chế IDO1 ở nồng độ 1,0 mM là 100%.

Từ kết quả trên có thể thấy, với các nhóm thế cũng nhƣ vị trí nhóm thế khác nhau trên vịng benzen sẽ cho ra hoạt tính của các dẫn chất là khác nhau.

Với cùng một nhóm thế, khi nhóm thế halogen ở vị trí số 4 (para) sẽ cho hoạt tính ức chế cao hơn khi nhóm thế ở vị trí số 3 (meta). Kết quả rõ nhất khi so sánh hai hợp chất Va và Vb, dù có cùng nhóm thế halogen là cloro, nhƣng hợp chất Vb với

nhóm thế ở vị trí số 4 cho kết quả phần trăm ức chế là 100%, cao hơn rất nhiều so với hợp chất Va chỉ với 49% có nhóm thể ở vị trí số 3 trên vịng benzen. Tƣơng tự hai hợp chất Vc và Vd có cùng nhóm thế floro nhƣng ở vị trí khác nhau là số 3 và 4 trên vòng

45

thơm cũng cho khả năng ức chế IDO1 là khác nhau tƣơng ứng là 57% và 65%. Điều này phù hợp với nghiên cứu SAR của Qian năm 2016 khi đã khẳng định vai trị của tƣơng tác tĩnh điện giữa nhóm thế ở vị trí số 4 của vịng benzen nằm trong pocket B với Arg231.

So sánh với kết quả đƣợc thực hiện trong bài báo cáo tốt nghiệp của dƣợc sĩ Dƣơng Văn Hiếu vào năm 2021, các chất X, Y, Z lần lƣợt là các chất khơng có nhóm thế, nhóm thế 2-Cl, 4-Br cho tác dụng ức chế IDO1 tƣơng ứng là 87%, 98%, 99%, kết quả cho thấy, so với chất X khơng có nhóm thế tạo vịng benzen:

STT Chất R % ức chế IDO1 tại nồng độ 1,0 mM 1 Va 3-Cl 49% 2 Vb 4-Cl 100% 3 Vc 3-F 57% 4 Vd 4-F 65% 5 X H 87% 6 Y 2-Cl 98% 7 Z 4-Br 99%

- Nhóm thế clo và flo ở vị trí số 3 đều làm giảm tác dụng ức chế, trong đó nhóm clo làm giảm tác dụng nhiều hơn (từ 87% giảm xuống cịn 49-57%). Có lẽ là do nhóm thế tại vị trí số 3 gây cản trở tƣơng tác của chất với pocket B và do nguyên tử flo có bán kính nhỏ hơn nên sự cản trở cũng nhỏ hơn so với nguyên tử clo.

- Nhóm thế clo và brom tại vị trí số 4 giúp tăng đáng kể khả năng ức chế IDO1 (từ 87% tăng lên đến 99-100%), nhƣng nhóm thế flo ở vị trí số 4 lại làm giảm tác dụng ức chế. Có thể là vì flo có bán kính nguyên tử nhỏ, độ âm điện lớn, các electron tự do kém linh động, khó tạo đƣợc tƣơng tác tĩnh điện với Arg231, trong khi clo và brom có bán kính ngun tử và độ âm điện phù hợp hơn, dễ dàng tiến gần và tạo tƣơng tác mạnh hơn với Arg231 của pocketB.

- Khi có thêm nhóm thế clo trên vịng benzen, nhóm thế ở vị trí số 4 cho tác dụng ức chế IDO1 tốt nhất (100%), sau đó là vị trí số 2 (98%), vị trí số 3 cho tác dụng

46 kém nhất (49%).

- Khi có thêm nhóm thế flo trên vịng benzen, tác dụng ức chế IDO1 đều giảm, giảm nhiều nhất khi nhóm thế ở vị trí số 3 (57%).

Mặc dù hoạt tính của các dẫn chất tổng hợp đƣợc chƣa thật sự vƣợt trội so với chất chứng dƣơng là IDO5L, nghiên cứu này đã cho thấy có thể tổng hợp các chất ức chế IDO1 tiềm năng mang khung indazol. Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã khẳng định lại và mở rộng thêm hiểu biết về liên quan cấu trúc tác dụng của mơ hình chất ức chế IDO1 để định hƣớng thiết kế cấu trúc của các hợp chất khác cho tác dụng ức chế mạnh hơn.

47

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1. KẾT LUẬN

Từ kết quả của nghiên cứu đã trình bày, nhóm nghiên cứu rút ra đƣợc một số kết luận nhƣ sau:

1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc:

- Nội dung khóa luận đã tổng hợp đƣợc 4 chất mục tiêu nhƣ dự kiến và cả 4 dẫn chất này đều chƣa từng đƣợc cơng bố trong bất kì tài liệu nào:

+ 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(3-clorophenyl) acetamid (Va).

+ 2-(6-amino-1 H-indazol-1-yl)-N-(4-cloro-phenyl) acetamid (Vb).

+ 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(3-florophenyl) acetamid (Vc). + 2-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(4-florophenyl) acetamid (Vd).

- Đã khẳng định đƣợc cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc nhờ phân tích các dữ liệu phổ hiện đại IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR. Từ đó, có thể khẳng định các dẫn chất đều đƣợc tổng hợp theo cơng thức nhƣ dự kiến.

1.2. Về hoạt tính sinh học

Đã tiến hành thử nghiệm khả năng ức chế IDO1 của các chất mục tiêu tổng hợp đƣợc, kết quả cho thấy:

- Tất cả các chất mục tiêu đều có khả năng ức chế IDO1 ở nồng độ 1 mM từ 49% trở lên.

- 3/4 chất mục tiêu có khả năng ức chế IDO1 ở nồng độ 1 mM từ 50% trở lên. Đặc biệt chất Vb có khả năng ức chế IDO1 tại 1,0 mM là 100%, cao bằng chất chứng so sánh IDO5L.

2. KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục tổng hợp các dẫn chất acetamid thơm có khung 1H-indazol-6-amin khác, đặc biệt là các dẫn chất mang nhóm thế para trên vòng benzen khác nhằm sàng lọc đƣợc các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh.

- Thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp đƣợc trên những dịng tế bào ung thƣ ngƣời mà IDO1 có hoạt tính cao nhƣ OVCAR8, OVCAR433, ES2.

4 8

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Christopher p. (2020), World Cancer Report.

2. Abbassi, N., et al. Studies on the reduction of the nitro group in 4- nitroindazoles by anhydrous SnCl2 in different alcohols. Synthetic Communications. 2011, 41(7), 999-1005.

3. Bellamy, F. and K. Ou. Selective reduction of aromatic nitro compounds with stannous chloride in non acidic and non aqueous medium. Tetrahedron Letters.

1984, 25(8), 839-842.

4. Bilir, C. and C.J.J.o.O.S. Sarisozen. Indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO): only an enzyme or a checkpoint controller?. Journal of Oncological Sciences. 2017, 3(2), 52-56.

5. Boyland, E. and D.J.B.J. Williams. The metabolism of tryptophan. 2. The metabolism of tryptophan in patients suffering from cancer of the bladder.

Biochemical Journal. 1956, 64(3), 578-582.

6. Buchbinder, E. I., & Desai, A. CTLA-4 and PD-1 pathways: similarities, differences, and implications of their inhibition. American journal of clinical oncology. 2016, 39(1), 98.

7. Chiesa, M. D., Carlomagno, S., Frumento, G., Balsamo, M., Cantoni, C., Conte, R., ... & Vitale, M.. The tryptophan catabolite L-kynurenine inhibits the surface expression of NKp46-and NKG2D-activating receptors and regulates NK-cell function. Blood. 2006, 108(13), 4118-4125.

8. Coluccia, A., et al. New Inhibitors of Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1: Molecular Modeling Studies, Synthesis, and Biological Evaluation. Journal of Medicinal Chemistry. 2016, 59(21), 9760-9773.

9. Daniyan, A. F., & Brentjens, R. J. Hiding in plain sight: immune escape in the era of targeted T-cell-based immunotherapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 2017, 14(6), 333-334.

10. Dunetz, J.R., J. Magano, and G.A. Weisenburger. Large-Scale Applications of Amide Coupling Reagents for the Synthesis of Pharmaceuticals. Organic Process Research & Development. 2016, 20(2), 140-177.

11. Fallarino, F., Grohmann, U., Vacca, C., Bianchi, R., Orabona, C., Spreca, A., & Puccetti. T cell apoptosis by tryptophan catabolism. Cell Death & Differentiation. 2002, 9(10), 1069-1077.

4 9 cell tolerogenicity. Immunological investigations. 2012, 41(6-7), 738-764.

13. Hoang, N.X., et al. Design, synthesis and bioevaluation of novel 6-substituted aminoindazole derivatives as anticancer agents. RSC Advances. 2020, 10(73),

45199-45206.

14. Hornyák, L., Dobos, N., Koncz, G., Karányi, Z., Páll, D., Szabó, Z., ... & Székvölgyi, L. The role of indoleamine-2, 3-dioxygenase in cancer development, diagnostics, and therapy. Frontiers in immunology. 2018, 151.

Một phần của tài liệu Tổng hợp và thử tác dụng ức chế indoleamin 2,3 dioxygenase 1 của một số dẫn chất acetamid mới mang khung 6 amino 1h indazol (Trang 48)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(73 trang)