Một số yếu tố có thể ảnh hƣởng tới tỉ lệ tạo thành tạp chất 17:
Xúc tác base: Dựa trên khảo sát với tác nhân DBU và TEA, chúng tôi nhận thấy rằng việc sử dụng một base mạnh nhƣ DBU cho khả năng tạo ra sản phẩm chính với hiệu suất cao hơn và hình thành ít tạp chất 17 so với TEA. Lý giải cho điều này có thể là do DBU có tính ái nhân lớn hơn so với TEA (pKa DBU-H lớn hơn pKa TEA-H) nên sẽ dễ dàng hút H+ để tạo trung tâm ái nhân R-O-
dễ thực hiện phản ứng acyl hóa [11].
Điều kiện nhiệt độ: Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng phản ứng thu đƣợc ít tạp chất 17 khi thực hiện ở nhiệt độ duy trì ở 0oC, lý do có thể do sự giảm nhiệt độ làm giảm tốc độ phản ứng diacyl hóa, do đó lƣợng tạp ít hơn đƣợc tạo thành. Một giả thuyết của V. Gopalsamuthiram và cộng sự cho rằng sự hình thành sản phẩm phụ 17 (sản phẩm phụ chính) địi hỏi hai phản ứng bậc hai liên tiếp nên việc giảm nhiệt độ phản ứng sẽ dẫn đến giảm đáng kể tốc độ của phản ứng acyl hóa vào nhóm NH2.
Tỉ lệ tác nhân anhydrid isobutyric: Do phản ứng hình thành sản phẩm chính 3 trên lý thuyết cần tỉ lệ tác nhân: sản phẩm 2 = 1:1, tỉ lệ này càng lớn, khả năng tạo ra dẫn chất diacyl hóa càng cao, do đó việc khống chế tỷ lệ để thu đƣợc sản phẩm chính cần đƣợc chú trọng. Do ở tỉ lệ dƣới 1,4:1, vết nguyên liệu vẫn chƣa biến mất, nên chúng tôi chọn tỉ lệ 1,4:1 để tiến hành phản ứng. Sản phẩm thu đƣợc vẫn xuất hiện vết tạp trên sắc ký đồ.
Quá trình tinh chế :
Quá trình tinh chế cần phải loại bỏ đƣợc base DBU và tác nhân anhydrid isobutyric chƣa phản ứng hết, do 2 chất đều là chất lỏng có độ nhớt cao, việc tồn tại trong sản phẩm sau phản ứng sẽ làm ảnh hƣởng đến quá trình xử lý thu đƣợc sản phẩm chính [24].
DBU trong dung mơi acetonitril có pKa lớn (24,34) trong khi nhóm chức amin trong sản phẩm 3 có pKa nhỏ (4,2) nên việc sử dụng một acid nhẹ có thể dễ dàng tạo muối và loại bỏ DBU khi chiết tách trong hệ pha nƣớc- hữu cơ [9], [11]. Anhydrid isobutyric dễ tan trong nƣớc và dẫn chất cytidin acetonid ester 3 thì tan tốt trong
35
bỏ đƣợc base và tác nhân còn dƣ [9]. Acid acetic cũng dễ dàng đƣợc loại bỏ nhờ đƣợc trung hòa bằng natri hydrocarbonat.
3.3.1.3. Tổng hợp ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-(hydroxyamino)-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)- 2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl isobutyrat (4) Sơ đồ tổng hợp: Cơ chế phản ứng (Hình 3.5) Hình 3.4. Cơ chế tạo thành hợp chất 4 Phân tích: Q trình phản ứng:
Phản ứng diễn ra theo cơ chế SN, với tác nucleophin là NH2OH, tấn cơng vào vị trí C-4 và đẩy nhóm NH2 ra ngồi (hình 3.5). Do cơ chế thế SN vào vịng thơm rất khó khăn, vì cấu trúc dị vịng thơm vốn rất giàu e, nên để phản ứng xảy ra cần duy trì nhiệt độ cao để đẩy nhanh tốc độ phản ứng. Do phản ứng khó xảy ra nên thời gian để phản ứng xảy ra dài (24 giờ).
Tác nhân ở đây chúng tôi sử dụng là muối hydroxylamin sulfat thay cho hydroxylamin bởi vì hydroxylamin có khả năng phát nổ khi đun nóng và gây ích ứng da, mắt, dị ứng khi tiếp xúc nên không đảm bảo an toàn để bảo quản và thực hiện trong điều kiện phịng thí nghiệm [22]. Việc sử dụng dạng muối sẽ an tồn và ít tác hại hơn.
36
Phản ứng xảy ra cần có cung cấp nhiệt độ, tuy nhiên theo khảo sát, việc nâng nhiệt độ lên cao (>85oC) phản ứng sẽ sinh ra nhiều tạp nên cần duy trì nhiệt độ ở mức 75-80oC để hiệu suất cao nhất.
Quá trình tinh chế
Sản phẩm 4 tạo thành có độ tan tốt trong ethyl acetat, nên chúng tôi quyết định chiết sản phẩm qua hệ dung mơi ethylacetat/ dung dịch NaCl bão hịa (1:1) để loại bỏ hồn tồn hydroxylamin sulfat cịn dƣ sau phản ứng [25]. Dung dịch thu đƣợc chiết tiếp với nƣớc để loại bỏ các tạp tan trong nƣớc trƣớc khi đƣợc cô cạn dung môi để thu đƣợc sản phẩm thơ. Một số tạp chất có thể hình thành khi tổng hợp chất 4 đƣợc thể
hiện ở Hình 3.6 [9].
Hình 3.5. Cấu trúc tạp chất có thể tạo thành khi tổng hợp chất 4
Theo các bài báo chúng tôi tham khảo ở quy mô tƣơng tự, phƣơng pháp tinh chế bằng sắc ký cột là cách phổ biến nhất để có thể thu đƣợc sản phẩm ở dạng tinh khiết [8]. Tuy nhiên để làm tiền đề nghiên cứu quy mô cao hơn, phƣơng pháp sắc ký cột không phải là lựa chọn tối ƣu. Vì vậy chúng tơi quyết định dùng phƣơng pháp kết tinh để tinh chế sản phẩm. Hệ dung môi chúng tôi sử dụng là H2O: CH3CN= 5:1 đã thành công kết tinh đƣợc sản phẩm. Sản phẩm thu đƣợc có một lƣợng nhỏ tạp molnupiravir dựa theo vết quan sát trên SKLM.
3.3.1.4. Tổng hợp ((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(4-(hydroxyamino)-2- oxopyrimidin-1(2H)-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl isobutyrat (Molnupiravir)(5)
Sơ đồ tổng hợp:
37
Hình 3.6. Cơ chế tạo thành sản phẩm molnupiravir
Phân tích:
Quá trình phản ứng:
Phản ứng trên là phản ứng phá vịng bảo vệ cetal để giải phịng nhóm diol dƣới xúc tác acid để tạo thành molnupiravir từ dẫn chất 4. Phản ứng phá vòng cetal dễ xảy ra nên không cần điều kiện nhiệt độ đặc biệt mà chỉ cần để ở nhiệt độ phòng, khuấy trong 7 giờ để hồn thành phản ứng (hình 3.7).
Hình 3.7. Cấu trúc tạp chất có thể tạo thành khi tổng hợp chất 5
Về mặt cơ chế, các xúc tác acid nhƣ H2SO4, HCl, H3PO4, acid Lewis đều có thể cho ra sản phẩm nhƣ mong muốn tuy nhiên, việc sử dụng acid cũng sẽ là tác nhân tạo ra các phản ứng không mong muốn nhƣ thủy phân liên kết ester ở vị trí C-5’ra sản phẩm 19, phản ứng oxy hóa khử nhóm hydroxylamin ra sản phẩm 6 hay phản ứng thế nucleophin ở vị trí C-4 tạo ra tạp uridin (xem Hình 3.8). Chính vì vậy, việc lựa chọn
38
acid là một vấn đề quan trọng để tạo ra sản phẩm chính với hiệu suất cao nhất . Theo tìm hiểu của chúng tơi qua các tài liệu, chúng tôi đã lựa chọn acid formic làm tác nhân acid hóa thu molnupiravir [9].
Q trình tinh chế
Để loại bỏ acid formic, chúng tôi sử dụng NH3 đậm đặc là một base thơng dụng để trung hịa acid còn dƣ sau phản ứng. Phản ứng trung hịa tỏa nhiều nhiệt nên bình phản ứng sẽ đƣợc làm lạnh trong nƣớc đá. Muối HCOONH4 sinh ra đƣợc loại bỏ dễ dàng bằng phƣơng pháp chiết.
Molnupiravir tan rất tốt trong THF nên chúng tôi lựa chọn dung môi chiết là THF để loại bỏ muối HCOONH4 vừa tạo thành [14]. Chiết tiếp trong dung dịch NaCl bão hòa để loại bỏ lƣợng muối có thể đã hịa tan trong pha hữu cơ. Dung dịch chứa sản phẩm và dung môi THF sau đó đƣợc cơ cạn để thu đƣợc sản phẩm dạng dầu. Do molnupiravir gần nhƣ không tan trong dung môi MTBE, nên chúng tôi đã sử dụng MTBE để làm kết tủa molnupiravir [14].
3.3.2. Bàn luận về kết quả phân tích phổ và cấu trúc các chất
3.3.2.1. Kết quả phân tích phổ muối 4-amino-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroxymethyl)- 2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)pyrimidin-2(1H)-one (1) sulfat
Trên phổ khối lƣợng (MS) xuất hiện pic có giá trị m/z = 567,1 tƣơng ứng với pic [2C12H17N3O5+ H]+, phù hợp với khối lƣợng phân tử của chất 2 (381 đvC, gốc base có khối lƣợng phân tử 283 đvC) [Phụ lục 4].
Phổ hồng ngoại (IR) xuất hiện đỉnh hấp thụ ở số sóng 3485 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết N-H trong nhóm amin. Tín hiệu của nhóm O-H alcol cho đỉnh hấp thụ đặc trƣng ở 3352 cm-1
, trong khi đó C-H no có đỉnh hấp thụ ở 2933 cm-1. Liên kết C=O có đỉnh hấp thụ ở số sóng 1722 cm-1. Liên kết C=N có đỉnh hấp thụ ở 1674 cm-1. Dải hấp thụ của liên kết C-O cho tín hiệu ở số sóng 1119;1250 cm-1 [Phụ
lục 1].
Phổ 1H-NMR xuất hiện 2 pic cho tín hiệu singlet ở độ dịch chuyển δ =1,29; 1,49 ppm tƣơng ứng với hidro của 2 nhóm –CH3 ở vị trí 2” và 3”. Trên phổ cũng xuất hiện tín hiệu ở độ dịch chuyển δ =3,57; 3,63 ppm tƣơng ứng hai hidro gắn với C-5’. Tín hiệu của H-4’ dạng doublet doublet ở độ dịch chuyển 4,25 ppm do tƣơng tác với 2H ở vị trí 5’ và 1H ở vị trí 3’. 2H ở vị trí 3’ và 2’ lần lƣợt cho tín hiệu doublet doublet ở độ dịch chuyển 4,75; 4,91 ppm. Tín hiệu doublet ở vị trí 5,79 ppm là của H-1’ do có tƣơng tác với 1H ở vị trí 2’ liền kề. H-5,6 ở dị vịng thơm cho tín hiệu doublet ở vị trí đặc trƣng nằm trong khoảng 6-8 ppm. Cuối cùng là 2H gắn với N trong nhóm –NH2 do chịu lực hút mạnh của N nên xuất hiện tín hiệu ở vùng trƣờng yếu với độ dịch chuyển lần lƣợt là 8,31; 9,49 ppm [Phụ lục 8].
39
Trên phổ 13C-NMR có 12 tín hiệu tƣơng ứng với 12C trong phân tử chất 2. Từ các kết quả phổ trên cho phép khẳng định đƣợc sản phẩm thu đƣợc là muối 4-amino-1- ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4- yl)pyrimidin-2(1H)-one (1) sulfat [Phụ lục 11].
3.3.2.2. Kết quả phân tích phổ ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-(hydroxyamino)-2- oxopyrimidin-1(2H)-yl)-2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl isobutyrat
Trên phổ khối lƣợng (MS) xuất hiện pic có giá trị m/z = 367,9 tƣơng ứng với pic [M-H]-, phù hợp với khối lƣợng phân tử của chất 4 (369 đvC) [Phụ lục 6].
Phổ hồng ngoại (IR) xuất hiện đỉnh hấp thụ ở số sóng 2980 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết C-H no. Tín hiệu của nhóm C=O cho đỉnh hấp thụ đặc trƣng ở 1703 cm-1, trong khi đó liên kết C=N vịng thơm có đỉnh hấp thụ ở 1674 cm-1. Dải hấp thụ của liên kết C-O cho tín hiệu ở số sóng 1074-1273 cm-1 [Phụ lục 2].
Phổ 1H-NMR xuất hiện 4 pic cho tín hiệu singlet ở độ dịch chuyển δ =1,09; 1,1; 1,29; 1,48 ppm với tích phân đều bằng 3 tƣơng ứng với hidro của 4 nhóm –CH3 ở 3b, 4b, 2a và 3a. Tín hiệu septet xuất hiện ở độ dịch chuyển δ = 2,56 ppm thuộc và H-2b do có sự tƣơng tác với 6H khu vực lân cận. Trên phổ cũng xuất hiện tín hiệu ở độ dịch chuyển 4,24 – 4,14 ppm tƣơng ứng hai hidro gắn với C-5’. So sánh với phổ 1H-NMR của sản phẩm 2 ở vị trí H-5’ có giá trị 3,63; 3,57 ppm, có thể nhận định rằng sự thay thế nhóm ester –COO cho nhóm alcol -OH đã làm tăng hiệu ứng –I khiến cho tín hiệu của 2 hidro này di chuyển về phía trƣờng yếu hơn. H-4’ cho tín hiệu multiplet ở 4,13- 4,11 ppm do có tƣơng tác với 3 H ở vị trí 5’ và 3’. 2H ở vị trí 3’ và 2’ lần lƣợt cho tín hiệu doublet doublet ở độ dịch chuyển 4,76; 4,95 ppm. Tín hiệu doublet ở vị trí 5,72 ppm là của H-1’ do có tƣơng tác với 1H ở vị trí 2’ liền kề. H-5,6 ở dị vịng N cho tín hiệu doublet ở vị trí đặc trƣng của H vịng thơm với tín hiệu có độ dịch chuyển ở 5,57; 6,88 ppm. So sánh với giá trị 6,08 và 8,13 ppm của H ở vị trí tƣơng đƣơng trong hợp chất 2 có thể thấy tín hiệu của H vòng thơm trong hợp chất 4 đã di chuyển về phía
trƣờng mạnh hơn. Có thể giải thích do sự thay thế nhóm hydroxyamin cho nhóm amin làm tăng hiệu ứng liên hợp +M cho vòng thơm dẫn đến mật độ điện tích e trên vịng tăng lên. Sự thay thế nhóm NHOH cho nhóm NH2 cũng đƣợc thể hiện ở việc xuất hiện tín hiệu singlet ở độ dịch chuyển δ = 10,05 ppm ( lớn hơn giá trị 9,49 ppm của tín hiệu H trong liên kết N-H ở hợp chất 2) vì trong liên kết NHOH, H bị hút e mạnh hơn do chịu tác động của cả O và N đứng cạnh. H trong nhóm –NH- cho tín hiệu ở độ dịch cuyển 9,62 ppm [Phụ lục 9].
Trên phổ 13
C-NMR có 15 tín hiệu tƣơng ứng với 16C trong phân tử chất 4, do có 2C hiện lên cùng một tín hiệu. Từ các kết quả phổ trên cho phép khẳng định đƣợc
40
sản phẩm thu đƣợc là ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-(hydroxyamino)-2-oxopyrimidin-1(2H)- yl)-2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl isobutyrat [Phụ lục 12].
3.3.2.3. Kết quả phân tích phổ ((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(4-(hydroxyamino)-2- oxopyrimidin-1(2H)-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl isobutyrat (Molnupiravir)
Trên phổ khối lƣợng (MS) xuất hiện pic có giá trị m/z = 327,9 tƣơng ứng với pic [M-H]-, phù hợp với khối lƣợng phân tử của chất 5 (329 đvC) [Phụ lục 7].
Phổ hồng ngoại (IR) xuất hiện đỉnh hấp thụ ở số sóng 3381 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết N-H trong nhóm hydroxyamin và nhóm OH alcol. Tín hiệu của nhóm C=O có đỉnh hấp thụ ở 1734 cm-1. Liên kết C=N có đỉnh hấp thụ ở số sóng 1639 cm-1
. Dải hấp thụ đặc trƣng liên kết C-O xuất hiện với số sóng 1125;1194;1275 cm-1 [Phụ lục 3].
Phổ 1H-NMR xuất hiện 1 pic cho tín hiệu ở độ dịch chuyển δ =1,10 ppm tƣơng ứng với 6 hidro của 2 nhóm –CH3 ở vị trí 3” và 4”. Việc mất đi 2 tín hiệu ở độ dịch chuyển δ =1,29; 1,49 ppm cũng cho thấy 2 nhóm methyl của hợp chất bảo vệ nhóm diol đã bị thủy phân mất. Tín hiệu septet xuất hiện ở độ dịch chuyển δ = 2,57 thuộc và H-2” do có sự tƣơng tác với 6H khu vực lân cận. Tín hiệu multiplet xuất hiện ở vùng 3,94 - 3,89 ppm của 2H gắn với C5’ gần với giá trị của H-5’ trong hợp chất 4 và cao hơn hợp chất 2 cho thấy nhóm ester –COO vẫn tồn tại. H-4’ cho tín hiệu quartet ở vị trí 4,00 ppm do có tƣơng tác với 3 H ở vị trí 5’ và 3’. 2H ở vị trí 3’ và 2’ lần lƣợt cho tín hiệu doublet doublet ở độ dịch chuyển 4,13; 4,21 ppm. So sánh với phổ 1H-NMR của sản phẩm 4, 2 H ở vị trí tƣơng đƣơng cho kết quả độ dịch chuyển 4,76; 4,95 ppm, rõ ràng đã có sự di chuyển về trƣờng mạnh hơn của H ở vị trí này, do sự mất nhóm bảo vệ cetal cyclic để trở về dẫn chất diol có thể làm tăng mật độ e ở khu vực này lên. 2H trong nhóm diol ở vị trí 3’; 2’ lần lƣợt cho tín hiệu doublet ở δ = 5,21;5,34 ppm, do có sự tƣơng tác với 1H ở C liền kề. Tín hiệu doublet ở vị trí 5,71 ppm là của H-1’ do có tƣơng tác với 1H ở vị trí 2’ liền kề. H-5,6 ở dị vịng thơm N cho tín hiệu doublet ở vị trí 5,58; 6,82 ppm. 2H nằm trong nhóm –NHOH do chịu lực hút mạnh từ hiệu ứng –I, +M nên độ dịch chuyển δ = 9,49;10,01 ppm [Phụ lục 10].
Trên phổ 13
C-NMR có 13 tín hiệu tƣơng ứng với 13C trong phân tử chất 5, do có 2. Từ các kết quả phổ trên cho phép khẳng định đƣợc sản phẩm thu đƣợc là ((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(4-(hydroxyamino)-2-oxopyrimidin-1(2H)-
41
3.3.2.4. So sánh giữa phổ 1H-NMR và 13C-NMR của sản phẩm tổng hợp được với dữ liệu phổ từng được báo cáo
Để kiểm tra tính chính xác của phổ hợp chất đo đƣợc, chúng tơi so sánh với dữ liệu phổ trong bài báo của V. Gopalsamuthiram và các cộng sự [9]. Số liệu đƣợc trình bày ở Bảng 3.11 và Bảng 3.12.
Bảng 3.11: Bảng so sánh giữa phổ 1H-NMR và 13C-NMR của sản phẩm trung gian
4 tổng hợp được với dữ liệu phổ từng được báo cáo
Sản phẩm trung gian 4 tổng hợp đƣợc Dữ liệu đƣợc báo cáo
1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6), δ (ppm) 10,05 (1H, s, OH); 9,62 (1H, d, J =1,8 Hz, NH); 6,88 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6); 5,72 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-1’); 5,57 (1H, dd, J1 = 8,4 Hz, J2 = 2,4 Hz, H-5); 4,95 (1H, dd, J1 = 6,0 Hz, J2 = 2,4 Hz, H-2’); 4,76 (1H, dd, J1 = 6,6 Hz, J2 = 4,2 Hz, H-3’); 4,24 - 4,14 (2H, m, H-5’); 4,13-4,11 (H, m, H-4’); 2,56 (1H, sept, J1 = 7,2 Hz H-2b); 1,48 (3H, s, H-2a); 1,29 (3H, s, H-3a); 1,10 (3H, s, H-3b); 1,09 (3H, s, H-4b) 1H-NMR (600 MHz, CD3OD), δ (ppm) 6,85 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 5,69 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 5,57 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 4,97–4,99 (dd, J = 6,4, 2,2 Hz, 1H); 4,79–4,81 (dd, J = 6,3; 4,8 Hz, 1H); 4,26 (d, J = 5,3 Hz, 2H); 4,21 (q, J = 4,9 Hz, 1H); 2.60 (septet, J = 7,0 Hz, 1H); 1,53 (s, 3H); 1,34 (s, 3H); 1,15–1,17 (dd, J = 7,0; 1,8 Hz, 6H) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6), δ (ppm) 175,87 (C-1b); 149,04 (C-2); 143,26 (C-4); 131,89 (C-6); 113,37 (C-1a); 98,66 (C-5); 91,22 (C-1’); 83,08 (C-2’,4’); 80,56 (C-3’); 63,79 (C-5’); 39,5 (C-2b); 33,04 (C-2a); 26,96 (C-3a) ); 25,16 (C-3b); ); 18,7 (C- 4b). 13C-NMR (151 MHz, CD3OD), δ (ppm) 178,61; 151,42; 146,49; 134,21; 115,73; 99,73; 94,53; 85,62; 85,58; 82,87; 65,54; 35,36; 30,97; 27,79; 25,82; 19,61; 19,58
42
Bảng 3.12: Bảng so sánh giữa phổ 1H-NMR và 13C-NMR của sản phẩm