Phụ
lục Chất CTCT
Đỉnh hấp
27 (cm-1) 1 2 3485 N-H (amin bậc 1) 3352 O-H (alcol) 2933 C-H (no) 1722 C=O 1674 C=N (vòng) 1119; 1250 C-O 2 4 2980 C-H (no) 1703 C=O 1674 C=N 1074; 1159; 1194; 1273 C-O 3 5 3381 N-H và O-H 2976; 2878 C-H (no) 1750 C=O 1639 C=N 1125; 1194; 1275 C-O Nhận xét: Từ Bảng 3.7 và phổ đồ (Phụ lục 1-3) có thể nhận dạng sơ bộ sự hiện
diện của một số nhóm chức nhƣ –NH2, -OH, C=O, C=N... thông qua các giá trị của dải hấp thụ, cƣờng độ pic, hình dạng pic.
3.2.2. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ khối lượng
Hợp chất CTPT Khối lƣợng phân tử
28 2 C12H17N3O5. H2SO4 381,0 567,1 [2C12H17N3O5+ H]+ 4 3 C16H23N3O6 353,0 707,1 [2M+H]+ 5 4 C16H23N3O7 369,0 367,9 [M-H]- 6 5 C13H19N3O7 329,3 327,9 [M-H]- 7
Nhận xét: Từ Bảng 3.8 và phổ đồ các chất (Phụ lục 6-9) cho thấy các phổ khối
đều có pic phù hợp với giá trị số khối dự kiến của chất cần phân tích với cƣờng độ mạnh. Pic phân mảnh ít, cƣờng độ nhỏ.
3.2.3. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
3.2.3.1. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR
Hợp
chất Cơng thức cấu tạo
1H-NMR (600MHz, DMSO- d6), δ (ppm) Phụ lục 2 9,49 (1H, s, NHa); 8,31 (1H, t, J = 3,6 Hz, NHb); 8,13 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-6); 6,08 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-5); 5,79 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-1’); 4,91 (1H, dd, J1 = 6,0 Hz, J2 = 1,8 Hz, H-2’); 4,75 (1H, dd, J1 = 6,0 Hz, J2 = 2,4 Hz, H-3’); 4,25 (1H, q, J = 4,2 Hz, H-4’); 3,63 (1H, dd, J1 = 12 Hz, J2 = 4,2 Hz, Ha-5’); 3,57 (1H, dd, J1 = 11,4 Hz, J2 = 4,2 Hz, Hb-5’); 1,49 (3H, s, H- 2”); 1,29 (3H, s, H-3”) 8 4 10,05 (1H, s, OH); 9,62 (1H, d, J = 1,8 Hz, NH); 6,88 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6); 5,72 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-1’); 5,57 (1H, dd, J1 = 8,4 Hz, J2 = 2,4 Hz, H-5); 4,95 (1H, dd, J1 = 6,0 Hz, J2 = 9
29 2,4 Hz, H-2’); 4,76 (1H, dd, J1 = 6,6 Hz, J2 = 4,2 Hz, H-3’); 4,24 - 4,14 (2H, m, H-5’); 4,13 - 4,11 (H, m, H-4’); 2,56 (1H, sept, J1 = 7,2 Hz, H-2b); 1,48 (3H, s, H-2a); 1,29 (3H, s, H- 3a); 1,10 (3H, s, H-3b); 1,09 (3H, s, H-4b) 5 10,01 (1H, s, -NH-OH); 9,49 (1H, d, J = 1,8 Hz, N-H); 6,82 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6); 5,71 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-1’); 5,58 (1H, dd, J1 = 8,4 Hz, J2 = 1,8 Hz, H-5); 5,34 (1H, dd, J = 6,0 Hz, OH tại C-2’); 5,21 (1H, d, J = 5,4 Hz, OH tại C-3’); 4,21 (1H, dd, J1 = 12,0 Hz, J2 = 3,0 Hz, H-2’); 4,13 (1H, dd, J1 = 12,0 Hz, J2 = 5,4 Hz, H-3’); 4,00 (1H, q, J = 5,4 Hz, H-4’); 3,94 – 3,89 (2H, m, H-5’); 2,57 (1H, sept, J = 7,2 Hz, H-2”); 1,10 (6H, dd, J1 =6,6 Hz, J2 = 1,2 Hz, H- 3”,4”) 10
Chú thích: Độ dịch chuyển hoá học (δ) được lấy theo giá trị trung bình (ppm); s:
singlet; t: triplet; d: doublet; dd: doublet doublet; sept: septet; m: multiplet.
Nhận xét: Phổ 1H-NMR của các hợp chất cho các tín hiệu số lƣợng proton, độ dịch chuyển hố học và độ bội tín hiệu phù hợp với các cơng thức dự kiến.
3.2.3.2. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR
Hợp
chất Công thức cấu tạo
13C-NMR (125MHz, DMSO- d6), δ (ppm) Phụ
30 2 159,24 (C-4); 146,31 (C-2); 112,63 (C-6); 93,22 (C-1”); 87,68 (C- 5); 84,40 (C-1’); 80,47 (C-4’); 61,04 (C-2’); 52,88 (C-3’); 39,57 (C- 5’); 26,89 (C-2”); 25,07 (C-3”) 11 4 175,87 (C-1b); 149,04 (C-2); 143,26 (C-4); 131,89 (C-6); 113,37 (C-1a); 98,66 (C-5); 91,22 (C-1’); 83,08 (C- 2’,4’); 80,56 (C-3’); 63,79 (C-5’); 39,5 (C- 2b); 33,04 (C-2a); 26,96 (C-3a) ); 25,16 (C-3b); ); 18,7 (C-4b). 12 5 175,95 (C-1”); 149,39 (C-2); 143,27 (C-4); 129,86 (C-6); 98,73 (C- 5); 87,72 (C-1’); 80,68 (C-4’); 71,92 (C-2’); 69,91 (C-3’); 63,84 (C- 5’); 39,50 (C-2”); 33,15 (C-3”); 18,75 (C-4”) 13 Chú thích: δ: độ dịch chuyển hố học (ppm)
Nhận xét: Phổ 13C-NMR của các hợp chất cho tín hiệu số lƣợng carbon, độ dịch chuyển hóa học của các carbon là phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến.
3.3. Bàn luận
3.3.1. Bàn luận về các phản ứng tổng hợp hoá học
3.3.1.1. Tổng hợp muối 4-amino-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroxymethyl)-2,2- dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)pyrimidin-2(1H)-one (1) sulfat (2)
31
Cơ chế phản ứng (Hình 3.1):
Hình 3.1. Cơ chế tạo thành dẫn chất acetonid 2
Phân tích:
Bƣớc đầu tiên trong quy trình tổng hợp molnupiravir là phản ứng cetal hóa để bảo vệ nhóm diol ở vị trí carbon 2’, 3’. Đây là bƣớc bảo vệ quan trọng vì tiếp theo quá trình sẽ là phản ứng acyl hóa gắn nhóm isobutyryl cần chọn lọc vào vị trí OH tại C-5’.
32
Tác nhân lựa chọn sử dụng ở đây là DMP trong dung môi aceton có điều kiện xúc tác acid đặc thay vì sử dụng aceton độc lập vì DMP có nhóm –OMe hút điện tử mạnh hơn -OH nên ở dạng trung gian dễ phản ứng hơn so với aceton.
Xúc tác H2SO4 đặc sử dụng không chỉ tạo môi trƣờng acid để cung cấp H+ để thực hiện phản ứng cetal hóa mà cịn có vai trò tạo muối để dễ kết tinh và thu đƣợc sản phẩm dƣới dạng chất rắn. H2SO4 đậm đặc 98% đƣợc sử dụng nên phản ứng tỏa nhiệt nhiều, do đó cần nhỏ từ từ từng giọt để đảm bảo an tồn.
Tuy nhiên chúng tơi nhận ra vấn đề là dẫn chất 2 tồn tại dƣới dạng muối nên dễ bị phân hủy về nguyên liệu cytidin ban đầu. Chính vì vậy, việc bảo quản dẫn chất 2 cần hết sức thận trọng, nếu không sử dụng ngay cần phải đặt trong bình hút ẩm để tránh việc biến đổi chất.
Do nhóm OH ở vị trí 2’,3’ nằm trên cùng một mặt phẳng và ở vị trí trans so với nhóm OH ở vị trí 5’ vì thế nên việc sử dụng xúc tác DMP sẽ dễ dàng tạo vịng acetal ở vị trí 2’,3’ thay vì đóng vịng với OH ở vị trí 5’.
3.3.1.2. Tổng hợp dẫn chất ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)- 2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl isobutyrat (3)
Sơ đồ tổng hợp:
33
Hình 3.2. Cơ chế acyl hóa tạo thành hợp chất 3
Phân tích:
Q trình phản ứng
Đây là phản ứng O-acyl hóa dẫn chất 2 ở vị trí C5’ dƣới xúc tác của base mạnh để thu đƣợc dạng cytidin acetonid ester 3. Do H ở nhóm alcol kém linh động nên cần sự có mặt của base mạnh làm xúc tác nhƣ DBU và TEA để tạo trung tâm ái nhân, dễ thực hiện phản ứng acyl hóa (xem Hình 3.2).
Các tác nhân acyl hóa có thể sử dụng trong phản ứng này là acid isobutyric, dẫn chất ester, isobutyryl halogenid hoặc anhydrid acid. Ở đây, isobutyric anhydrid đƣợc lựa chọn do là tác khả năng acyl hóa mạnh, dễ thực hiện phản ứng và là một hóa chất thơng dụng trong phịng thí nghiệm.
Dẫn chất trung gian 2 tồn tại dƣới dạng muối, dƣới tác dụng của base mạnh nhƣ DBU, sẽ giải phóng gốc –NH2, do đó, có 2 trung tâm ái nhân của chất 2 ở vị trí nhóm NH2 và OH có thể acyl hóa. Những tạp chất có thể có trong phản ứng này ngồi sản phẩm chính là tạp 17, 18 ( xem Hình 3.3).
Theo nghiên cứu của V. Gopalsamuthiram và cộng sự, sự có mặt của dẫn chất diacyl hóa 17 có thể tạo ra nhiều tạp cho phản ứng tiếp theo, trong đó sản phẩm chính
4 thu đƣợc với hiệu suất thấp nên cần hạn chế việc tạo ra tạp chất này ở phản ứng hiện
34
Hình 3.3. Cấu trúc tạp chất có thể tạo trong q trình tổng hợp chất 3
Một số yếu tố có thể ảnh hƣởng tới tỉ lệ tạo thành tạp chất 17:
Xúc tác base: Dựa trên khảo sát với tác nhân DBU và TEA, chúng tôi nhận thấy rằng việc sử dụng một base mạnh nhƣ DBU cho khả năng tạo ra sản phẩm chính với hiệu suất cao hơn và hình thành ít tạp chất 17 so với TEA. Lý giải cho điều này có thể là do DBU có tính ái nhân lớn hơn so với TEA (pKa DBU-H lớn hơn pKa TEA-H) nên sẽ dễ dàng hút H+ để tạo trung tâm ái nhân R-O-
dễ thực hiện phản ứng acyl hóa [11].
Điều kiện nhiệt độ: Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng phản ứng thu đƣợc ít tạp chất 17 khi thực hiện ở nhiệt độ duy trì ở 0oC, lý do có thể do sự giảm nhiệt độ làm giảm tốc độ phản ứng diacyl hóa, do đó lƣợng tạp ít hơn đƣợc tạo thành. Một giả thuyết của V. Gopalsamuthiram và cộng sự cho rằng sự hình thành sản phẩm phụ 17 (sản phẩm phụ chính) địi hỏi hai phản ứng bậc hai liên tiếp nên việc giảm nhiệt độ phản ứng sẽ dẫn đến giảm đáng kể tốc độ của phản ứng acyl hóa vào nhóm NH2.
Tỉ lệ tác nhân anhydrid isobutyric: Do phản ứng hình thành sản phẩm chính 3 trên lý thuyết cần tỉ lệ tác nhân: sản phẩm 2 = 1:1, tỉ lệ này càng lớn, khả năng tạo ra dẫn chất diacyl hóa càng cao, do đó việc khống chế tỷ lệ để thu đƣợc sản phẩm chính cần đƣợc chú trọng. Do ở tỉ lệ dƣới 1,4:1, vết nguyên liệu vẫn chƣa biến mất, nên chúng tôi chọn tỉ lệ 1,4:1 để tiến hành phản ứng. Sản phẩm thu đƣợc vẫn xuất hiện vết tạp trên sắc ký đồ.
Quá trình tinh chế :
Quá trình tinh chế cần phải loại bỏ đƣợc base DBU và tác nhân anhydrid isobutyric chƣa phản ứng hết, do 2 chất đều là chất lỏng có độ nhớt cao, việc tồn tại trong sản phẩm sau phản ứng sẽ làm ảnh hƣởng đến quá trình xử lý thu đƣợc sản phẩm chính [24].
DBU trong dung mơi acetonitril có pKa lớn (24,34) trong khi nhóm chức amin trong sản phẩm 3 có pKa nhỏ (4,2) nên việc sử dụng một acid nhẹ có thể dễ dàng tạo muối và loại bỏ DBU khi chiết tách trong hệ pha nƣớc- hữu cơ [9], [11]. Anhydrid isobutyric dễ tan trong nƣớc và dẫn chất cytidin acetonid ester 3 thì tan tốt trong
35
bỏ đƣợc base và tác nhân còn dƣ [9]. Acid acetic cũng dễ dàng đƣợc loại bỏ nhờ đƣợc trung hòa bằng natri hydrocarbonat.
3.3.1.3. Tổng hợp ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-(hydroxyamino)-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)- 2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl isobutyrat (4) Sơ đồ tổng hợp: Cơ chế phản ứng (Hình 3.5) Hình 3.4. Cơ chế tạo thành hợp chất 4 Phân tích: Q trình phản ứng:
Phản ứng diễn ra theo cơ chế SN, với tác nucleophin là NH2OH, tấn cơng vào vị trí C-4 và đẩy nhóm NH2 ra ngồi (hình 3.5). Do cơ chế thế SN vào vịng thơm rất khó khăn, vì cấu trúc dị vịng thơm vốn rất giàu e, nên để phản ứng xảy ra cần duy trì nhiệt độ cao để đẩy nhanh tốc độ phản ứng. Do phản ứng khó xảy ra nên thời gian để phản ứng xảy ra dài (24 giờ).
Tác nhân ở đây chúng tôi sử dụng là muối hydroxylamin sulfat thay cho hydroxylamin bởi vì hydroxylamin có khả năng phát nổ khi đun nóng và gây ích ứng da, mắt, dị ứng khi tiếp xúc nên không đảm bảo an toàn để bảo quản và thực hiện trong điều kiện phịng thí nghiệm [22]. Việc sử dụng dạng muối sẽ an tồn và ít tác hại hơn.
36
Phản ứng xảy ra cần có cung cấp nhiệt độ, tuy nhiên theo khảo sát, việc nâng nhiệt độ lên cao (>85oC) phản ứng sẽ sinh ra nhiều tạp nên cần duy trì nhiệt độ ở mức 75-80oC để hiệu suất cao nhất.
Quá trình tinh chế
Sản phẩm 4 tạo thành có độ tan tốt trong ethyl acetat, nên chúng tôi quyết định chiết sản phẩm qua hệ dung mơi ethylacetat/ dung dịch NaCl bão hịa (1:1) để loại bỏ hồn tồn hydroxylamin sulfat cịn dƣ sau phản ứng [25]. Dung dịch thu đƣợc chiết tiếp với nƣớc để loại bỏ các tạp tan trong nƣớc trƣớc khi đƣợc cô cạn dung môi để thu đƣợc sản phẩm thơ. Một số tạp chất có thể hình thành khi tổng hợp chất 4 đƣợc thể
hiện ở Hình 3.6 [9].
Hình 3.5. Cấu trúc tạp chất có thể tạo thành khi tổng hợp chất 4
Theo các bài báo chúng tôi tham khảo ở quy mô tƣơng tự, phƣơng pháp tinh chế bằng sắc ký cột là cách phổ biến nhất để có thể thu đƣợc sản phẩm ở dạng tinh khiết [8]. Tuy nhiên để làm tiền đề nghiên cứu quy mô cao hơn, phƣơng pháp sắc ký cột không phải là lựa chọn tối ƣu. Vì vậy chúng tơi quyết định dùng phƣơng pháp kết tinh để tinh chế sản phẩm. Hệ dung môi chúng tôi sử dụng là H2O: CH3CN= 5:1 đã thành công kết tinh đƣợc sản phẩm. Sản phẩm thu đƣợc có một lƣợng nhỏ tạp molnupiravir dựa theo vết quan sát trên SKLM.
3.3.1.4. Tổng hợp ((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(4-(hydroxyamino)-2- oxopyrimidin-1(2H)-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl isobutyrat (Molnupiravir)(5)
Sơ đồ tổng hợp:
37
Hình 3.6. Cơ chế tạo thành sản phẩm molnupiravir
Phân tích:
Q trình phản ứng:
Phản ứng trên là phản ứng phá vòng bảo vệ cetal để giải phịng nhóm diol dƣới xúc tác acid để tạo thành molnupiravir từ dẫn chất 4. Phản ứng phá vòng cetal dễ xảy ra nên không cần điều kiện nhiệt độ đặc biệt mà chỉ cần để ở nhiệt độ phòng, khuấy trong 7 giờ để hồn thành phản ứng (hình 3.7).
Hình 3.7. Cấu trúc tạp chất có thể tạo thành khi tổng hợp chất 5
Về mặt cơ chế, các xúc tác acid nhƣ H2SO4, HCl, H3PO4, acid Lewis đều có thể cho ra sản phẩm nhƣ mong muốn tuy nhiên, việc sử dụng acid cũng sẽ là tác nhân tạo ra các phản ứng không mong muốn nhƣ thủy phân liên kết ester ở vị trí C-5’ra sản phẩm 19, phản ứng oxy hóa khử nhóm hydroxylamin ra sản phẩm 6 hay phản ứng thế nucleophin ở vị trí C-4 tạo ra tạp uridin (xem Hình 3.8). Chính vì vậy, việc lựa chọn
38
acid là một vấn đề quan trọng để tạo ra sản phẩm chính với hiệu suất cao nhất . Theo tìm hiểu của chúng tơi qua các tài liệu, chúng tôi đã lựa chọn acid formic làm tác nhân acid hóa thu molnupiravir [9].
Q trình tinh chế
Để loại bỏ acid formic, chúng tôi sử dụng NH3 đậm đặc là một base thông dụng để trung hòa acid còn dƣ sau phản ứng. Phản ứng trung hịa tỏa nhiều nhiệt nên bình phản ứng sẽ đƣợc làm lạnh trong nƣớc đá. Muối HCOONH4 sinh ra đƣợc loại bỏ dễ dàng bằng phƣơng pháp chiết.
Molnupiravir tan rất tốt trong THF nên chúng tôi lựa chọn dung môi chiết là THF để loại bỏ muối HCOONH4 vừa tạo thành [14]. Chiết tiếp trong dung dịch NaCl bão hòa để loại bỏ lƣợng muối có thể đã hịa tan trong pha hữu cơ. Dung dịch chứa sản phẩm và dung mơi THF sau đó đƣợc cơ cạn để thu đƣợc sản phẩm dạng dầu. Do molnupiravir gần nhƣ không tan trong dung môi MTBE, nên chúng tôi đã sử dụng MTBE để làm kết tủa molnupiravir [14].
3.3.2. Bàn luận về kết quả phân tích phổ và cấu trúc các chất
3.3.2.1. Kết quả phân tích phổ muối 4-amino-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroxymethyl)- 2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)pyrimidin-2(1H)-one (1) sulfat
Trên phổ khối lƣợng (MS) xuất hiện pic có giá trị m/z = 567,1 tƣơng ứng với pic [2C12H17N3O5+ H]+, phù hợp với khối lƣợng phân tử của chất 2 (381 đvC, gốc base có khối lƣợng phân tử 283 đvC) [Phụ lục 4].
Phổ hồng ngoại (IR) xuất hiện đỉnh hấp thụ ở số sóng 3485 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết N-H trong nhóm amin. Tín hiệu của nhóm O-H alcol cho đỉnh hấp thụ đặc trƣng ở 3352 cm-1
, trong khi đó C-H no có đỉnh hấp thụ ở 2933 cm-1. Liên kết C=O có đỉnh hấp thụ ở số sóng 1722 cm-1. Liên kết C=N có đỉnh hấp thụ ở 1674 cm-1. Dải hấp thụ của liên kết C-O cho tín hiệu ở số sóng 1119;1250 cm-1 [Phụ
lục 1].
Phổ 1H-NMR xuất hiện 2 pic cho tín hiệu singlet ở độ dịch chuyển δ =1,29; 1,49 ppm tƣơng ứng với hidro của 2 nhóm –CH3 ở vị trí 2” và 3”. Trên phổ cũng xuất hiện tín hiệu ở độ dịch chuyển δ =3,57; 3,63 ppm tƣơng ứng hai hidro gắn với C-5’. Tín hiệu của H-4’ dạng doublet doublet ở độ dịch chuyển 4,25 ppm do tƣơng tác với 2H ở vị trí 5’ và 1H ở vị trí 3’. 2H ở vị trí 3’ và 2’ lần lƣợt cho tín hiệu doublet doublet ở độ dịch chuyển 4,75; 4,91 ppm. Tín hiệu doublet ở vị trí 5,79 ppm là của H-1’ do có