Mơ tả q trình:
Từ nguyên liệu đầu vào cytidin (1), phản ứng cetal hóa bảo vệ nhóm diol đƣợc thực hiện bằng phản ứng với DMP trong dung môi aceton dƣới xúc tác của acid sulfuric đậm đặc. Quá trình diễn ra trong 24 giờ tạo hợp chất muối acetonid 2.
Phản ứng ester hóa giữa hợp chất 2 với anhydrid isobutyric trong điều kiện xúc tác base mạnh DBU và DMAP, khuấy đều trong 3 giờ ở nhiệt độ 0o
C tạo ra dẫn chất cytidin acetonid ester 3.
Hợp chất 3 sau đó tác dụng với muối (NH2OH)2.H2SO4 trong dung môi IPA 70% ở điều kiện nhiệt độ duy trì 75-78oC đã xảy ra phản ứng hydroxyamin hóa để thành dẫn chất 4.
Acid formic đƣợc thêm vào và duy trì ở nhiệt độ phịng để thủy phân nhóm bảo vệ acetonid của hợp chất 4 thu đƣợc sản phẩm molnupiravir [9].
2.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến một số phản ứng quan trọng.
Tỉ lệ mol
Dung môi phản ứng
Loại base xúc tác
Nhiệt độ thực hiện
2.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc của các hợp chất trung gian và sản phẩm cuối cùng tổng hợp được. sản phẩm cuối cùng tổng hợp được.
Phƣơng pháp SKLM
19
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học
Sử dụng các phản ứng cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến: acyl hóa, ester hóa, hydroxyamin hóa, thủy phân, trung hòa.
Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 với các hệ dung môi khai triển khác nhau: n- Butanol: acid acetic: nƣớc (9:2:2,5)-hệ A, Ethyl acetat-hệ B, quan sát sắc ký đồ dƣới bƣớc sóng 254 nm của đèn tử ngoại.
Sử dụng phƣơng pháp cất, lọc, chiết lỏng-lỏng, chiết rắn-lỏng, kết tinh… để tinh chế sản phẩm.
2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được
Phƣơng pháp SKLM với các điều kiện nhƣ đã trình bày ở Mục 2.3.1. Dựa vào đặc điểm hình ảnh trên sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm.
Phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt. Dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm.
2.3.3. Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được
Cấu trúc của hợp chất trung gian và sản phẩm cuối đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so sánh nhiệt độ nóng chảy, các vết thu đƣợc trên SKLM và xác định bằng các phƣơng pháp phổ: phổ khối lƣợng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và 13C (13C-NMR).
Phổ khối lượng MS:
Đƣợc đo tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên máy 920-MS TQ-FT, hãng Agilent Technologies.
Phổ hồng ngoại IR:
Đƣợc ghi tại Khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén kali bromid trong vùng 4000- 400 cm-1.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon-13 (13C-NMR):
Đƣợc đo tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên máy Bruker 600 MHz Advance Neo, chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
20
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả thực nghiệm 3.1. Kết quả thực nghiệm 3.1.1. Tổng hợp muối 4-amino-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(hydroxymethyl)-2,2- dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)pyrimidin-2(1H)-one (1) sulfat (2) Sơ đồ phản ứng: Cách tiến hành Thực hiện phản ứng:
Thêm vào trong bình đáy trịn 100 mL, cytidin (1,00 g, 4,12 mmol), aceton khan (13,0 ml), tiếp theo là thêm 2,2-dimethoxypropan (2,6 ml, 20,6 mmol, 5 đƣơng lƣợng). Acid sulfuric đặc (0,55 ml, 9,4 mmol, 2,3 đƣơng lƣợng) đƣợc thêm từng giọt vào bình cầu, tạo huyền phù bằng cách khuấy đều và khuấy liên tục trong trong 24 giờ thu đƣợc hỗn hợp màu đỏ nâu.
Tinh chế sản phẩm
Phần cặn không tan đƣợc lọc hút chân không và kết tủa rắn đƣợc rửa nhiều lần bằng aceton, sau đó là diethyl ether đến khi mất màu thu đƣợc chất rắn màu trắng, sấy khô trong chân không trong một ngày và thu đƣợc 1,50 g.
Kết quả:
Khối lƣợng sản phẩm: 1,50 g.
Nhiệt độ nóng chảy: 133-135 oC
Hiệu suất: 96,0%.
Sắc ký lớp mỏng: Rf = 0,56 (hệ dung môi A)
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng:
Ảnh hƣởng của xúc tác DMP đến việc hình thành sản phẩm 2 (xem Bảng 3.1)
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của DMP đến việc hình thành sản phẩm 2
STT Điều kiện Cảm quan SKLM theo dõi phản ứng Hiệu suất 1 Có sử dụng DMP Chất rắn màu trắng Có 2 vết, 1 vết sản phẩm đậm, 1 vết nguyên liệu mờ 96% 2 Không sử dụng DMP Chất rắn màu trắng Có 2 vết, 1 vết nguyên liệu đậm, 1 vết sản phẩm mờ -
21 Sắc ký đồ chạy trên hệ A
Nhận xét: Phản ứng khơng có xúc tác DMP vẫn cịn vết ngun liệu rất đậm. Do
đó, sự có mặt của DMP là cần thiết cho việc phản ứng tạo muối acetonid 2 đƣợc xảy ra nhanh hơn.
Ảnh hƣởng của việc sử dụng dung môi đến việc hình thành sản phẩm 2
Để khảo sát việc ảnh hƣởng của dung mơi tới việc hình thành sản phẩm 2, tiến hành phản ứng trong các dung môi khác nhau: aceton, acetonitril, tetrahydrofuran và methanol. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của dung mơi đến việc hình thành sản phẩm 2
STT Dung môi SKLM theo dõi phản ứng Hiệu suất
1 Aceton Có 1 vết sản phẩm 96%
2 Acetonitril Có 2 vết, 1 vết nguyên liệu đậm, 1 vết sản phẩm mờ
-
3 THF Có 1 vết sản phẩm 92,5%
4 Methanol Có 2 vết, 1 vết nguyên liệu và vết sản phẩm đậm nhƣ nhau
-
Nhận xét: Qua khảo sát chúng tơi thấy rằng có 2 dung mơi tạo điều kiện tốt để
phản ứng xảy ra hồn tồn là THF và aceton. Trong đó việc sử dụng aceton cho hiệu suất sản phẩm cao hơn nên chúng tơi lựa chọn đó là dung mơi thực hiện phản ứng.
3.1.2. Tổng hợp dẫn chất ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)- 2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl isobutyrat (3)
22
Cách tiến hành:
Thực hiện phản ứng
Chuẩn bị bình cầu đáy trịn 100 ml đặt trên máy khuấy từ, cho hợp chất vừa điều chế (1,30 g, 3,41 mmol, 1 đƣơng lƣợng) và acetonitril (13,0 mL), tiếp theo là DMAP (0,09 g, 0,73 mmol, 0,2 đƣơng lƣợng) và DBU (1,1 ml, 7,16 mmol, 2,1 đƣơng lƣợng) đƣợc thêm vào ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp đƣợc khuấy trong 10 phút đến khi huyền phù trở thành dung dịch trong suốt thì thêm vào từng giọt anhydrid isobutyric (0,8 ml , 4,8 mmol, 1,4 đƣơng lƣợng) ở 0°C. Chia lƣợng anhydrid isobutyric thành hai phần bằng nhau (0,4 ml), mỗi phần thêm cách nhau nửa giờ và hỗn hợp phản ứng đƣợc duy trì trong 3 giờ ở cùng nhiệt độ. Sau đó sản phẩm trong bình đƣợc cơ đặc trực tiếp dƣới áp suất giảm để thu đƣợc chất rắn dạng sáp trắng bám quanh thành bình.
Tinh chế sản phẩm
Cặn thu đƣợc đƣợc hòa tan lại trong dicloromethan (10,0 mL) và đƣợc rửa bằng acid acetic 10% ba lần, mỗi lần 10,0 ml. Sau đó, chiết lấy pha hữu cơ vào bình cầu đáy trịn dung tích 100ml và thêm từng giọt dung dịch natri hydrocarbonat bão hòa (10 ml). Khuấy đều cho đến khi phản ứng hết sủi bọt. Sau đó, tách lớp dicloromethan và làm khô bằng natri sulphat khan. Lọc và cô đặc dung dịch dƣới áp suất giảm để thu đƣợc chất rắn màu trắng xốp.
Kết quả:
Khối lƣợng sản phẩm: 1,10 g.
Hiệu suất: 90,6%.
Sắc ký lớp mỏng: Rf = 0,72 (hệ dung môi A)
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng:
Xúc tác base và nhiệt độ phản ứng
Để khảo sát ảnh hƣởng của loại xúc tác base và nhiệt độ tới việc hình thành sản phẩm 3, tiến hành phản ứng với hai loại base là DBU và TEA ở 2 mốc nhiệt độ là 25 oC và 0 o
C. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.3.
23
STT Nhiệt độ
(℃) Xúc tác base
Hiệu suất (%)
Đặc điểm SKLM theo dõi phản ứng 1 25 DBU 85 2 vết, 1 vết sản phẩm chính, 1 vết tạp mờ 2 25 TEA - 2 vết, 1 vết sản phẩm chính, 1 vết tạp đậm kéo đi 3 0 DBU 90,6 2 vết, 1 vết sản phẩm chính, 1 vết tạp rất mờ 4 0 TEA - 2 vết, 1 vết sản phẩm chính, 1 vết tạp đậm
Nhận xét: Qua khảo sát, chúng tôi thấy rằng việc sử dụng DBU cho sản phẩm sạch hơn và tỉ lệ tạp thu đƣợc nhỏ hơn so với TEA. Điều này đóng vai trị vơ cùng quan trọng vì sản phẩm trung gian ở bƣớc này không đƣợc kết tinh mà chỉ tinh chế thơng qua hình thức chiết nên khó loại đƣợc tạp xuất hiện. Thơng qua khảo sát, yếu tố nhiệt độ cũng có tác động tới tỉ lệ tạp sinh ra. Lựa chọn điều kiện phản ứng ở 0 oC để thu đƣợc sản phẩm hiệu suất cao nhất.
Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Ảnh hưởng tỉ lệ mol tới sự hình thành hợp chất 3
STT Tỉ lệ mol giữa chất (2) và anhydrid isobutyric
Đặc điểm SKLM theo dõi phản ứng Hiệu suất (%) 1 1:1,1 2 vết, 1 vết sản phẩm đậm, 1 vết nguyên liệu đậm - 2 1:1,4 2 vết, 1 vết sản phẩm đậm, 1 vết tạp mờ 90,6 3 1:1,7 2 vết, 1 vết sản phẩm đậm, 1 vết tạp mờ 88,7 4 1:2,0 2 vết, 1 vết sản phẩm mờ, 1 vết tạp đậm -
Nhận xét: Việc điều chỉnh tỉ lệ giữa chất 2 và anhydrid isobutyric cần cân nhắc
giữa việc làm hết vết nguyên liệu và tạo ra tạp. Chúng tôi lựa chọn tỉ lệ giữa hai chất là 1:1,4 để có thể phản ứng hết vết nguyên liệu, thu đƣợc tạp ít nhất và sử dụng ít anhydrid isobutyric. Tác nhân anhydrid isobutyric là chất lỏng dạng dầu rất khó loại bỏ trong bƣớc tinh chế nên cần sử dụng ở lƣợng ít nhất có thể.
3.1.3. Tổng hợp ((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-(hydroxyamino)-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)- 2,2-dimethyltetrahydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl)methyl isobutyrat (4)
24
Cách tiến hành:
Thực hiện phản ứng
Cho vào bình cầu đáy tròn 100 mL đã đặt trên máy khuấy từ, hợp chất vừa điều chế (1,00 g, 2,71 mmol) và hydroxylamin sulfat (1,33 g, 8,13 mmol), tiếp theo là IPA 70% (10,0 mL ) đƣợc thêm vào, gia nhiệt lên 60 oC và khuấy đều để chất rắn tan hoàn toàn tạo dung dịch đồng nhất. Dung dịch đƣợc đun nóng đến 78 o
C ( nhiệt độ bên trong vào khoảng 72-73 ˚C) và giữ tại mức nhiệt độ này trong 24 giờ, tại thời điểm đó SKLM cho thấy sự hình thành sản phẩm ngồi ngun liệu ban đầu và molnupiravir. Ethanol (10 mL) đƣợc thêm vào làm đồng dung môi và cô hết dung môi thu đƣợc sản phẩm dạng dầu sệt có màu nâu vàng lẫn chất rắn màu trắng.
Tinh chế sản phẩm
Đối với sản phẩm thơ, hịa tan lại vào 10,0 ml ethyl acetat và thêm 10,0 ml dung dịch NaCl bão hòa, lắc đều 5 phút, đợi đến khi hai pha tách ra rồi chiết lấy lớp ethyl acetat. Chiết tiếp lớp ethyl acetat lần hai với 10 ml nƣớc cất, thu lấy lớp ethyl acetat rồi làm khan bằng Na2SO4. Dung dịch sau lọc đƣợc cô dƣới áp suất giảm thu đƣợc chất rắn có màu trắng nhạt bám quanh thành bình.
Để kết tinh sản phẩm, 1 ml acetonitril đƣợc thêm vào bình sản phẩm, lắc đều phân tán chất rắn tạo thành hỗn dịch màu trắng đục, sau đó cho thêm tiếp 5 ml nƣớc cất, khuấy đều thấy xuất hiện kết tinh dƣới đáy bình. Cạo nhẹ thành bình để quá trình kết tinh xảy ra nhanh hơn. Để n bình trong 2 tiếng, sau đó tiến hành lọc rửa tủa tinh thể trên phễu lọc thƣờng. Sản phẩm sau đó làm khơ dƣới đèn hồng ngoại thu đƣợc chất rắn màu trắng ánh hồng nhạt.
Kết quả:
Khối lƣợng sản phẩm: 0,59 g.
Hiệu suất: 59,0%.
Nhiệt độ nóng chảy: 152-154 ℃.
Sắc ký lớp mỏng: Rf = 0,88 (hệ dung môi A); 0,69 (hệ dung môi B).
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng:
25
Để đánh giá ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả năng hình thành sản phẩm 4, khảo sát
phản ứng ở các các mốc nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ phòng đến 90 oC. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5.Ảnh hưởng của nhiệt độ tới việc hình thành sản phẩm 4
STT Nhiệt độ (℃) Thời gian phản ứng (phút) Hiệu suất sau tinh chế (%)
Đặc điểm SKLM theo dõi phản ứng 1 65-70 30 giờ 48,2 2 vết, 1 vết sản phẩm, 1 vết tạp đậm 2 75-80 24 giờ 59,0 2 vết, 1 vết sản phẩm, 1 vết tạp mờ 3 85-90 - - 2 vết tạp, sản phẩm không xuất hiện
Nhận xét: Tăng nhiệt độ làm tăng hiệu suất và giảm thời gian phản ứng, tuy nhiên nếu nhiệt độ phản ứng quá cao (trên 85 oC) sản phẩm có thể bị phân hủy ra tạp. Vì vậy, chúng tơi tiến hành phản ứng ở 75-80 oC.
3.1.4. Tổng hợp((2R,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(4-(hydroxyamino)-2-oxopyrimidin- 1(2H)-yl)tetrahydrofuran-2-yl)methyl isobutyrat (molnupiravir)(5)
Sơ đồ tổng hợp:
Cách tiến hành:
Thêm vào bình cầu đáy trịn 50 mL đặt trên máy khuấy từ, hợp chất 4 (0,5 g, 1,36 mmol), tiếp theo là acid formic (5,0 mL). Dung dịch thu đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng trong 7 giờ.
Trung hòa acid formic bằng cách nhỏ từ từ từng giọt NH3 đặc (khoảng 20 ml) dƣới nhiệt độ thấp ( nhỏ hơn 5 oC) đến pH trung tính (dùng chất chỉ thị vạn năng để kiểm tra). Đƣa dung dịch thu đƣợc qua bình chiết, thêm tiếp 20,0 ml THF và lắc mạnh trong 5 phút. Tách lớp THF và tiếp tục chiết với 20,0 ml dung dịch NaCl bão hòa. Thu lại lớp THF và làm khan với Na2SO4.
Cô dung dịch dƣới áp suất giảm loại bỏ dung môi thu đƣợc sản phẩm dạng dầu màu vàng nhạt. Thêm 5,0 ml MTBE thấy xuất hiện chất rắn màu trắng bám quanh
26
thành bình. Cạo quanh thành bình để thu lại chất rắn, và lọc lấy chất rắn qua phễu lọc thƣờng.
Chất rắn đƣợc làm khô dƣới đèn hồng ngoại thu đƣợc sản phẩm molnupiravir có màu trắng ngà. .
Kết quả:
Khối lƣợng sản phẩm: 0,2 g.
Hiệu suất: 44,6% .
Nhiệt độ nóng chảy: 154-156 ℃ ( TLTK: 158-160 ℃ [6] )
Sắc ký lớp mỏng: Rf = 0,78 (hệ dung môi A); 0,33 (hệ dung môi B)
Các kết quả về nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng và hiệu suất các chất đã tổng hợp đƣợc tóm tắt trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Tóm tắt Rf, nhiệt độ nóng chảy và hiệu suất của các chất tổng hợp được
Chất Hệ dung môi pha
động Rf
Nhiệt độ nóng chảy (oC)
Hiệu suất tổng hợp (%) 2 n-BuOH: AcOH: H2O
= 9:2:2,5 0,56 133- 135 96
3 n-BuOH: AcOH: H2O
= 9:2:2,5 0,72 - 90,6 4 n-BuOH: AcOH: H2O = 9:2:2,5 0,88 153-154 59 EtOAc 0,69 5 n-BuOH: AcOH: H2O = 9:2:2,5 0,78 154-156 44,7 EtOAc 0,33
Nhận xét: Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp đƣợc gần với nhiệt độ
nóng chảy của molnupiravir trong tài liệu tham khảo (158-160 oC)[6]. Quy trình tổng hợp đƣợc thực hiện với hiệu suất tổng thể là 22,9%.
3.2. Xác định cấu trúc các chất tổng hợp đƣợc bằng phƣơng pháp phổ
3.2.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)
Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại
Phụ
lục Chất CTCT
Đỉnh hấp
27 (cm-1) 1 2 3485 N-H (amin bậc 1) 3352 O-H (alcol) 2933 C-H (no) 1722 C=O 1674 C=N (vòng) 1119; 1250 C-O 2 4 2980 C-H (no) 1703 C=O 1674 C=N 1074; 1159; 1194; 1273 C-O 3 5 3381 N-H và O-H 2976; 2878 C-H (no) 1750 C=O 1639 C=N 1125; 1194; 1275 C-O Nhận xét: Từ Bảng 3.7 và phổ đồ (Phụ lục 1-3) có thể nhận dạng sơ bộ sự hiện
diện của một số nhóm chức nhƣ –NH2, -OH, C=O, C=N... thông qua các giá trị của dải hấp thụ, cƣờng độ pic, hình dạng pic.
3.2.2. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ khối lượng
Hợp chất CTPT Khối lƣợng phân tử
28 2 C12H17N3O5. H2SO4 381,0 567,1 [2C12H17N3O5+ H]+ 4 3 C16H23N3O6 353,0 707,1 [2M+H]+ 5 4 C16H23N3O7 369,0 367,9 [M-H]- 6 5 C13H19N3O7 329,3 327,9 [M-H]- 7
Nhận xét: Từ Bảng 3.8 và phổ đồ các chất (Phụ lục 6-9) cho thấy các phổ khối
đều có pic phù hợp với giá trị số khối dự kiến của chất cần phân tích với cƣờng độ mạnh. Pic phân mảnh ít, cƣờng độ nhỏ.
3.2.3. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
3.2.3.1. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)