2.3.2. Phương pháp đánh giá
22
1) Tính chất: đánh giá bằng cảm quan.
2) Độ ẩm: xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô trên cân xác
định độ ẩm nhanh Ohaus. Bột được phân tán với khối lượng khoảng 1,0 g; nhiệt độ sấy 105 – 110 °C, thời gian: tự động.
3) Tỷ trọng biểu kiến: tỷ trọng biểu kiến được tính theo cơng thức [1]:
D = m
V Trong đó :
- D: tỷ trọng biểu kiến của khối bột (g/mL); - m: khối lượng khối bột (g);
- V: thể tích biểu kiến của khối bột (mL).
4) Hàm lượng bacoside:
Phương pháp định lượng hàm lượng bacoside trong cao rau đắng biển dựa theo USP 43 – NF 38 [31]: Điều kiện sắc ký: - Detector: UV 205 nm; - Cột: 4,6 mm × 25 cm; 5 mm; - Nhiệt độ cột: 27 ± 1 0C; - Tốc độ dịng chảy: 1,5 mL/phút; - Thể tích tiêm: 20 µl Chuẩn bị mẫu:
- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 5 mg bacoside A3 chuẩn vào bình định mức 5 mL. Thêm khoảng 3 mL MeOH, siêu âm trong khoảng 15 phút cho tan hết, bổ sung MeOH cho vừa đủ thể tích, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/mL.
- Dãy dung dịch chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng với MeOH, thu được dãy dung dịch chuẩn với nồng độ như bảng 2.7.
Bảng 2.7. Nồng độ của dãy dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ (µg/mL) 50,00 25,00 12,50 6,25 3,13 1,56 0,78
- Dung dịch thử: cân một lượng chế phẩm tương đương với 25 mg bacoside cho vào BĐM 25 mL, thêm 15 mL MeOH, siêu âm khoảng 15 phút cho tan hết. Định mức vừa đủ bằng MeOH, lắc đều. Ly tâm bằng máy Mikro 200 với tốc độ 14000 vòng/phút, trong thời gian 5 phút, thu lấy dịch.
23
- Dung dịch C: hòa tan 0,14 g kali dihydro phosphat khan (KH2PO4) trong 900 mL nước, thêm 0,5 mL dung dịch acid phosphoric, pha loãng bằng nước đến 1000 mL, trộn, lọc, và đuổi khí.
- Dung dịch D: sử dụng acetonitril đã lọc và loại khí. Chương trình dung mơi được trình bày như bảng 2.8.
Bảng 2.8. Chương trình dung mơi dùng trong phân tích RĐB bằng HPLC
Thời gian (phút) Dung dịch C (%) Dung dịch D (%)
0 70 30
25 60 40
26 70 30
30 70 30
Cách tiến hành:
- Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần. Lập đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic theo nồng độ.
- Tiến hành sắc ký đối với dung dịch thử. Nồng độ mẫu thử được xác định thông qua đường chuẩn đã xây dựng.
Cách tính kết quả:
Thời gian lưu tương đối và hệ số chuyển đổi của các hợp chất (theo USP 43 – NF38) được trình bày trong bảng 2.9.
Bảng 2.9. Thời gian lưu tương đối và hệ số chuyển đổi của các hợp chất trong RĐB
STT Hợp chất Thời gian lưu tương đối Hệ số chuyển đổi
1 Bacopaside I 0,73 1,03
2 Bacoside A3 1,00 1,00
3 Bacopaside II 1,04 0,81
4 Bacopaside X 1,15 0,99
5 Bacopasaponin C 1,22 0,75
Từ kết quả phân tích các dung dịch chuẩn cùng với hệ số chuyển đổi, lập phương
trình hồi quy tuyến tính Spic = Cx+b biểu thị mối tương quan giữa diện tích pic và nồng
độ của từng hoạt chất (yêu cầu r2 ≥ 0,995).
Nồng độ của mỗi hoạt chất bacopaside I, bacoside A3, bacopaside II, bacopaside
X, bacopasaponin C được tính theo cơng thức: C = Spica-b
Hàm lượng của mỗi hoạt chất bacopaside I, bacoside A3, bacopaside II, bacopaside X, bacopasaponin C được tính theo cơng thức
% mỗi hợp chất = C×V
m×(1-100 )h
24
Hàm lượng hoạt chất bacoside trong chế phẩm được tính bằng tổng hàm lượng của các hợp chất bacopaside I, bacoside A3, bacopaside II, bacopaside X, bacopasaponin C.
% HL bacoside = % bacopaside I + % bacoside
A3 + % bacopaside II + % bacopaside X + % bacopasaponin C
Trong đó:
- a, b là hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính; - C: nồng độ mỗi hợp chất (mg/mL);
- V: thể tích pha lỗng (mL);
- m: khối lượng cân của chế phẩm (mg); - h: độ ẩm của cao (%).
5) Đánh giá khả năng giải phóng của bacoside trong cao RĐB:
Tiến hành thử độ hòa tan của chế phẩm theo phụ lục 11.4, DĐVN V [7]: - Thiết bị hòa tan: kiểu cánh khuấy
- Tốc độ khuấy: 100 vòng/phút.
- Mơi trường thử hịa tan: mỗi cơng thức được đánh giá độ hịa tan song song trong 3 môi trường: dung dịch acid HCl pH 1,2; đệm phosphat pH 4,5; đệm phosphat pH 6,8.
- Thể tích mơi trường thử hịa tan: 500 mL. - Nhiệt độ: 37 ± 0,5 °C.
- Thời điểm lấy mẫu: lấy mẫu tại các thời điểm 0,5 phút; 3 phút; 5 phút; 10 phút; 15 phút; 20 phút; 30 phút; 45 phút; 60 phút; 75 phút; 90 phút; 120 phút; 240 phút.
Tiến hành: cân chính xác khoảng một lượng chế phẩm chứa 150 mg bacoside vào
cốc thử hịa tan chứa mơi trường đã được điều nhiệt. Vận hành thiết bị với các thông số đã nêu, lấy mẫu ở các thời điểm đã định, mỗi lần hút chính xác 10 mL mơi trường thử hòa tan, ly tâm bằng máy Mikro 200 với tốc độ 14000 vòng/phút, trong thời gian 5 phút. Dịch thu được đem định lượng bằng phương pháp HPLC, tính lượng hoạt chất đã hịa tan tại mỗi thời điểm. Sau mỗi lần lấy mẫu, bổ sung 10 mL mơi trường hịa tan vào cốc.
Mẫu chuẩn: thực hiện theo phương pháp định lượng được trình bày ở mục 2.3.2.1. Cách tính kết quả:
Nồng độ Cn từng hoạt chất bacopaside I, bacoside A3, bacopaside II, bacopaside
X, bacopasaponin C ở lần hút thứ n được tính theo phương trình đường chuẩn tương ứng:
Cn = Spic - b
a
Khối lượng mỗi hoạt chất bacopaside I, bacoside A3, bacopaside II, bacopaside X, bacopasaponin C đã giải phóng ở lần hút thứ n được tính theo cơng thức:
mn = Cn×500+10×∑n Ci-1
25
Tổng khối lượng bacoside đã giải phóng tại thời điểm thứ n là:
mbacoside (n) = mbacopaside I(n) + mbacopaside A3(n) + mbacopaside II(n) + mbacopaside X(n) + mbacopasaponin C(n)
Tỷ lệ hoạt chất bacoside giải phóng tại thời điểm thứ n là Qn=mbacoside (n)
mcân×HL ×100 (%)
Trong đó:
- a, b là hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính;
- Cn là nồng độ từng hoạt chất ở lần hút thứ n (mg/mL);
- mn là khối lượng từng hoạt chất ở lần hút thứ n (mg);
- mbacoside (n) là tổng khối lượng bacoside đã giải phóng tại thời điểm thứ n (mg);
- Qn là tỷ lệ bacoside giải phóng (độ hịa tan) ở thời điểm thứ n (%);
- mcân là khối lượng chế phẩm đem thử hòa tan (mg);
- HL là hàm lượng hoạt chất bacoside trong chế phẩm.
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá vi hạt, cốm pha hỗn dịch a. Phương pháp đánh giá vi hạt
❖ Phương pháp đánh giá tương tác dược chất – tá dược của vi hạt
1) Đánh giá bằng phổ FT – IR: tiến hành đo phổ trên thiết bị quang phổ hồng
ngoại Agilent. Mẫu được trộn với KBr tỷ lệ khối lượng khoảng 1:10 rồi ép thành viên.
Quét phổ trong khoảng 4000 – 400 cm-1. Quá trình đo diễn ra trong điều kiện độ ẩm
dưới 60 %.
2) Đánh giá bằng phương pháp phân tích nhiệt vi sai: mẫu thử được đưa vào
một đĩa nhôm, đậy nắp, dùng lực dập để dính chặt nắp vào đĩa. Đĩa nhơm trắng được sử dụng làm mẫu trắng. Đưa hai đĩa nhôm vào buồng gia nhiệt, bắt đầu tăng nhiệt độ từ 30
– 250 oC. Nhập khối lượng cân vào máy tính và xử lý kết quả thu được.
❖ Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của vi hạt
1) Tính chất: đánh giá bằng cảm quan.
2) Độ ẩm: trình bày tại mục 2.3.2.1.
3) Tỷ lệ vi hạt thuộc phân đoạn 45 – 75 µm:
Cân chính xác p gam chế phẩm, rây qua rây số 75. Cân xác định lượng chế phẩm không qua rây số 75 là: m (g)
Lượng chế phẩm qua được rây số 75 tiếp tục được rây qua rây số 45. Cân xác định lượng chế phẩm qua được rây số 45 là: n (g)
Tỷ lệ vi hạt thuộc phân đoạn 45 – 75 µm được xác định theo cơng thức: X = p - (m+n)
26 Trong đó:
- p: lượng chế phẩm đánh giá (g)
- m: lượng chế phẩm không qua rây số 75 (g) - n: lượng chế phẩm qua rây số 45 (g)
- X: tỷ lệ vi hạt thuộc phân đoạn 45 – 75 µm (%)
Yêu cầu: tỷ lệ vi hạt thuộc phân đoạn 45 – 75 µm > 90 %
4) Định lượng, thử độ hịa tan: trình bày tại mục 2.3.2.1.
5) Đánh giá khả năng che vị: xác định gián tiếp thơng qua tỷ lệ bacoside giải phóng trong mơi trường pH 6,8: sau 0,5 phút đầu bacoside khơng giải phóng ra xem như đã che vị đắng, tỷ lệ giải phóng sau 3 phút và 5 phút càng ít thì khả năng che vị càng tốt.
b. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cốm pha hỗn dịch.
1) Tính chất: đánh giá bằng cảm quan
2) Độ ẩm: trình bày tại mục 2.3.2.1
3) Độ trơn chảy: chỉ số Carr (CI) biểu thị cho khả năng trơn chảy của cốm, được
tính theo cơng thức: CI = Vthơ-Vgõ
Vthơ ×100 (%)
Trong đó: Vthơ là thể tích cốm trước gõ; Vgõ là thể tích cốm sau gõ.
Mối tương quan giữa độ trơn chảy và chỉ số Carr được trình bày ở bảng 2.10 [1].
Bảng 2.10. Mối tương quan giữa mức độ trơn chảy và chỉ số Carr
Chỉ số Carr (%) Độ trơn chảy
≤ 10 Rất tốt 11 – 15 Tốt 16 – 20 Khá 21 – 25 Trung bình 26 – 31 Kém 32 – 37 Rất kém ≥ 38 Vô cùng kém
4) Định lượng, thử độ hịa tan: trình bày tại mục 2.3.2.1.
5) Đánh giá khả năng che vị: trình bày tại mục 2.3.2.2.
6) Đánh giá khả năng phân tán: phân tán 3 g cốm trong 30 mL nước cất. Sau 10
phút lấy lượng dịch như nhau ở các vị trí khác nhau cho vào ống eppendorf rồi đem ly tâm bằng máy Mikro 200 với tốc độ 14000 vòng/phút, trong thời gian 5 phút. Thu lấy cặn đem cân. Tính RSD.
Yêu cầu: RSD < 3,0 %
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả trung bình. Các số liệu được xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn SD, độ lệch chuẩn tương đối RSD. Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2016.
27
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá một số đặc tính cao rau đắng biển nguyên liệu 3.1. Kết quả đánh giá một số đặc tính cao rau đắng biển nguyên liệu
3.1.1. Đặc tính vật lý
1) Tính chất: bột màu nâu, mịn, vị đắng – mặn. 2) Hàm ẩm: 3,763 ± 0,022 %
3) Tỷ trọng biểu kiến: 0,475 ± 0,031 g/mL
3.1.2. Hàm lượng bacoside
Tiến hành xác định hàm lượng bacoside theo phương pháp trình bày tại mục 2.3.1.2, kết quả thu được như sau:
Kết quả xây dựng đường chuẩn:
STT Nồng độ (µg/mL) Diện tích pic (mAu.S) 1 53,50 552277 2 26,75 256799 3 13,38 135179 4 6,69 62010 5 3,34 31950 6 1,67 15073 7 0,84 8016