STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Progesteron Hubei Gedian Humanwell USP41
2 Viên nang Utrogestan® 100 mg
Số lơ: 5162 HSD: 9/2023 Sản xuất: Besins (Pháp)
TCNSX
3 Tween 80 Trung Quốc BP 2020
4 Acid Oleic Xilong Scientific - Trung Quốc BP 2020 5 CaCl2.2H2O Xilong Scientific - Trung Quốc TCNSX
6 NaCl Xilong Scientific - Trung Quốc TCNSX
7 NaOH Xilong Scientific - Trung Quốc TCNSX
8 KH2PO4 Xilong Scientific - Trung Quốc TCNSX
9 Acid maleic Trung Quốc TCNSX
10 Tris(hydroxymethyl)
aminomethane Merck KGaA TCNSX
11 Glycerin Việt Nam DĐVN V
12 Gelatin Geltech - Hàn Quốc TCNSX
13 Methyl paraben Trung Quốc TCNSX
14 Propyl paraben Trung Quốc TCNSX
15 Pancreatin Shyuanye - Trung Quốc TCNSX
16 Phospholipid Lipoid - Đức TCNSX
17 NaTDC Trung Quốc TCNSX
18 4-Bromophenylboronic
acid 9Dingchem - Trung Quốc TCNSX
19 MgSO4 Xilong Scientific - Trung Quốc TCNSX
20 Heparin Hàn Quốc TCNSX
21 Methanol sắc ký Daejung Chemicals - Hàn Quốc TCNSX
22 Ethanol Việt Nam DĐVN V
18
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
Bảng 2.2. Thiết bị nghiên cứu
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Máy ly tâm lạnh Universal 320R Anh
2 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Mỹ
3 Cân kỹ thuật Sartorius TE3102S Đức
4 Cân phân tích Sartorius BP121S Đức
5 Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H Đức
6 Máy ly tâm để bàn Hermile Z200A Anh
7 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Agilent LC-MS/MS Mỹ
8 Bể điều nhiệt WiseBath Đức
9 Cân xác định độ ẩm Ohaus MB25 Mỹ
10 Máy đo thế zeta và xác định phân bố kích thước giọt
Zetasizer NanoZS90 Anh
11 Thiết bị thử độ hòa tan Erweka - DT Đức
12 Máy khuấy từ IKA RET basic Đức
13 Máy đo pH để bàn Mettler Toledo SevenCompact S220K Trung Quốc 14 Tủ lạnh, cân kỹ thuật, cân phân tích, các dụng cụ thủy
tinh khác…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu hồn thiện cơng thức hệ nano tự nhũ hóa thơng qua q trình đánh giá ly giải lipid đánh giá ly giải lipid
- Đánh giá hiệu quả của phương pháp ly giải lipid đối với hệ nano tự nhũ hóa. - Đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng PGT trong SNEDDS tới quá trình ly giải lipid.
2.2.2. Nghiên cứu bào chế và đánh giá viên nang mềm chứa progesteron
- Bào chế và đánh giá ảnh hưởng của vỏ nang gelatin tới quá trình ly giải lipid của hệ SNEDDS.
- Đánh giá khả năng ức chế tái kết tinh PGT của gelatin.
- Thử giải phóng viên nang mềm chứa hệ SNEDDS progesteron
2.2.3. Nghiên cứu đánh giá in vivo trên thỏ
- Đánh giá SKD đường uống của hệ SNEDDS trên thỏ và so sánh với viên đối chiếu Utrogestan® và mẫu nguyên liệu.
19
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế
2.3.1.1. Bào chế hệ nano tự nhũ hóa chứa progesteron
Cân một lượng chính xác chất diện hoạt và đồng dung môi vào lọ thủy tinh, thêm pha dầu, đồng nhất hỗn hợp. Thêm chính xác lượng dược chất vào, khuấy trên máy khuấy từ đến tan hoàn toàn. Hệ sau khi đồng nhất là hệ nano tự nhũ hóa chứa progesteron. Hệ được bảo quản ở nhiệt độ phòng tới khi sử dụng [7].
2.3.1.2. Phương pháp bào chế viên nang mềm bằng phương pháp nhúng khuôn
Tiến hành bào chế nang mềm ở quy mô nhỏ bằng phương pháp nhúng khuôn như sau [6]:
Pha chế dịch vỏ nang: cân các thành phần nguyên liệu theo công thức. Đun cách thủy nước tinh khiết ở nhiệt độ 70-75ºC, hịa tan các chất bảo quản, chất hóa dẻo trong nước. Tiến hành hòa tan gelatin ở nhiệt độ 65ºC, để yên khoảng 2 giờ cho gelatin trương nở hoàn toàn, thỉnh thoảng khuấy trộn nhẹ nhàng bằng đũa thủy tinh. Hạn chế sự hình thành bọt trong quá trình khuấy trộn.
Tạo vỏ nang: dịch vỏ nang được duy trì ở trạng thái lỏng (ở điều kiện 50ºC). Khn kim loại hình trái xoan được nhúng vào dịch vỏ nang trong 5 giây, sau đó được nhấc lên và quay nhẹ nhàng trong 5 giây cho dung dịch vỏ nang bám đều vào khuôn. Khi nhúng xong, cắt phần thừa bị chảy xuống phía cuối, để nguội cho vỏ nang ổn định, sau đó kéo nhẹ nhàng vỏ ra khỏi khuôn (tránh làm rách vỏ). Làm khơ vỏ trong bình hút ẩm ở điều kiện thường.
Đóng dịch nhân và hàn vỏ nang: vỏ nang sau khi làm khô, xác định sơ bộ độ ẩm của vỏ nang bằng cân xác định độ ẩm, vỏ nang đạt yêu cầu độ ẩm trong khoảng từ 5- 8%. Tiến hành đóng hệ SNEDDS đã chuẩn bị trước: dùng bơm tiêm 1 ml đóng dịch vào trong nang, kiểm sốt khối lượng dịch đóng nang. Sau khi đóng thuốc, dùng 1 phần vỏ nang khác hàn kín bằng nhiệt để tạo thành viên nang hoàn chỉnh.
2.3.2. Phương pháp đánh giá in vitro
2.3.2.1. Phương pháp định lượng progesteron bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Để định lượng PGT trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tham khảo khóa luận của Ds Nguyễn Thị Ngọc Thơ và Ths Vũ Thị Thanh Thủy [5, 7]. Điều kiện tiến hành như sau:
Điều kiện chạy sắc ký
- Thiết bị: Máy HPLC Shimadzu (Nhật)
- Cột sắc ký Aligent C18 kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm - Pha động là hỗn hợp methanol: nước cất (80:20), siêu âm 20 phút
20 - Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Nhiệt độ: 400C - Thể tích tiêm: 20 µl
- Detector UV phát hiện ở bước sóng 254 nm Xử lý mẫu
Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,0300g progesteron hịa tan trong 50,00 ml dung mơi ethanol sau đó bổ sung nước từ từ đến vừa đủ 100 ml, siêu âm 10 phút thu được dung dịch S1 có nồng độ chính xác khoảng 300 µg/ml.
Lần lượt hút một lượng mẫu từ dung dịch S1 pha loãng bằng pha động thành các dung dịch từ S2 đến S6 tương ứng với nồng độ: 6, 12, 30, 60, 150 µg/ml.
Dãy dung dịch chuẩn từ S1 đến S6 được lọc qua màng lọc 0,45 µm. Phương pháp thẩm tra các chỉ tiêu:
Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn progesteron 150 µg/ml với điều kiện sắc ký ở trên. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu và diện tích pic trung bình. Giá trị RSD (độ lệch chuẩn tương đối) của diện tích pic và thời gian lưu phải ≤ 2%.
Độ tuyến tính
Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn từ S1 đến S6 trong điều kiện đã chọn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Hệ số tương quan tuyến tính R2 phải ≥ 0,99.
2.3.2.2. Xác định tỉ lệ progesteron trong chế phẩm đối chiếu Utrogestan® 100 mg
Cân chính xác khoảng 0,0300 g dịch nhân, pha trong 5 ml diclomethan và định mức vừa đủ 10,0 ml. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên và định mức vừa đủ 10,0 ml bằng methanol. Tiến hành chạy HPLC như mô tả bên trên.
2.3.2.3. Đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt
Sử dụng phương pháp tán xạ laser trên thiết bị Zetasizer Nano ZS90 (Anh). Chuẩn bị pha keo chứa nhũ tương trong môi trường ly giải. Nhũ tương tạo được có tốc độ đếm tiểu phân (Count rate) nằm trong khoảng 200-400 kcps. Sử dụng cuvet thủy tinh, chỉ số khúc xạ RI là 1,542 và độ hấp thụ là 0,010. Phương pháp tham khảo tại tài liệu [25].
2.3.2.4. Đánh giá khả năng ly giải lipid in vitro của hệ nano tự nhũ hóa
Các SNEDDS có khả năng tự nhũ hóa tạo các hạt nhũ tương kích thước vùng nano mà khơng cần q trình nhào trộn và nhũ hóa thơ tại dạ dày, q trình tiêu hóa chủ yếu diễn ra nhanh chóng tại ruột. Vì vậy, đề tài chọn mơ hình một ngăn để đánh giá q trình ly giải in vitro cho các công thức SNEDDS.
21
Tham khảo chuỗi bài báo nghiên cứu hướng tới việc thiết lập các thử nghiệm in
vitro tiêu chuẩn cho các công thức dựa trên lipid [12, 44, 49-52] và dựa vào điều kiện
sẵn có ở bộ mơn, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm ly giải như sau:
Chuẩn bị dịch chiết pancreatin: Phân tán 1 g bột panceratin trong 5 ml đệm (Tris maleat 2mM, CaCl2.2H2O 1,4mM, NaCl 150mM) làm lạnh 2-8ºC. Điều chỉnh hỗn dịch về pH 6,5 bằng NaOH 5M, ly tâm hỗn dịch 4000 vòng/phút trong 15 phút. Hút 4 ml phần dịch trong để chuẩn bị cho q trình tiêu hóa (hoạt độ pancreatin lipase ≥ 800 U/ml).
Tiến hành nhũ hóa và ly giải: Cân chính xác khoảng 1 g mẫu thử vào cốc có mỏ 100 ml. Thêm 36 ml mơi trường tiêu hóa (Tris maleat 2mM; CaCl2.2H2O 1,4mM; NaCl 150mM; NaTDC 3mM; PC 0,75mM), phân tán hỗn hợp trên bằng máy khuấy từ: con khuấy 2,5cm, 37ºC, tốc độ 450 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó chỉnh về pH 6,5 rồi thêm 4 ml dịch chiết pancreatin đã chuẩn bị ở trên để bắt đầu q trình ly giải. pH mơi trường tiêu hóa ln được duy trì ở pH 6,5 nhờ chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,2M.
Ghi lại thể tích NaOH 0,2M sử dụng theo thời gian để dự đoán tốc độ và mức độ ly giải.
Thu thập và xử lý mẫu: Sau 30 phút tiến hành hút 4 ml mẫu và sự ly giải lipid bị ức chế ngay lập tức với 20 μL dung dịch acid 4-bromophenylboronic (1,0M trong methanol). Các mẫu được ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 30 phút.
Xác định nồng độ PGT trong pha dầu: Sử dụng micropipet hút một thể tích chính xác lớp dầu phía trên cùng, sau đó pha lỗng bằng methanol và định lượng bằng HPLC. Xác định kích thước giọt và nồng độ PGT trong pha keo: Gạn bỏ hết phần dầu, dùng micropipet hút chính xác phần pha keo phía trên, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm, đo kích thước giọt và xác định nồng độ PGT bằng HPLC.
Xác định lượng PGT trong pha kết tủa: Gạn bỏ hết phần dầu và pha keo, tiến hành cắt bỏ phần trên của ống ly tâm để tránh nhiễm, hòa tủa vào 5 ml methanol và định lượng bằng HPLC.
Xác định độ hòa tan của PGT trong pha keo
Độ hòa tan của PGT trong pha keo được xác định bằng cách ly giải SNEDDS trắng (không chứa PGT) sau 30 phút phân hủy như mơ tả ở trên. Sau đó hút 4 ml pha keo chuyển vào lọ thủy tinh có nút cao su và bọc giấy bạc. Khuấy từ 37°C và thêm PGT dần vào tới dư, tiếp tục khuấy từ trong 24 giờ. Sau đó tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút.
Thu phần pha keo phía trên, lọc qua màng PTFE 0,45 µm và pha lỗng 100 lần với methanol trước khi định lượng bằng HPLC. Giá trị độ hòa tan trong pha keo được sử dụng để tính tốn tỉ lệ siêu bão hịa (SR) thu được sau 30 phút ly giải thông qua công thức sau:
22
𝑆𝑅 = 𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑃𝐺𝑇 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎 𝑘𝑒𝑜 𝑠𝑎𝑢 𝑘ℎ𝑖 𝑙𝑦 𝑔𝑖ả𝑖 Độ ℎò𝑎 tan 𝑃𝐺𝑇 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎 𝑘𝑒𝑜
2.3.3. Phương pháp đánh giá viên nang mềm
2.3.3.1. Phương pháp thử giải phóng viên nang mềm chứa hệ nano tự nhũ hóa progesteron
Điều kiện thử giải phóng:
- Thiết bị thử độ hòa tan Erweka - DT kiểu cánh khuấy - Môi trường thử: 900 ml môi trường đệm phosphat 6,8 - Tốc độ cánh khuấy: 100 vòng/phút
- Nhiệt độ: 37 ± 0,5ºC
- Với viên nang mềm có vỏ khơng rã, tiến hành thử với mơi trường có thêm enzym pepsin (750000 units hoặc ít hơn trong 1000 ml) [15].
Chuẩn bị mẫu: viên nang mềm chứa SNEDDS progesteron theo công thức và viên đối chiếu Utrogestan® 100 mg
Tiến hành thử và lấy mẫu: cho mẫu vào môi trường. Sau các khoảng thời gian: 5, 15, 30, 45, 60 và 120 phút, hút khoảng 5 ml dịch trong cốc sau đó bù lại một lượng mơi trường thử tương ứng.
Xử lý dịch: dịch hút được ly tâm 5000 vịng/phút trong 10 phút, pha lỗng thích hợp bằng methanol, lọc qua màng PTFE 0,45 μm Sau đó đem định lượng bằng phương pháp HPLC.
2.3.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế tái kết tinh của gelatin bằng phương pháp thay đổi dung môi
Tham khảo phương pháp thay đổi dung môi được phát triển bởi nhóm nghiên cứu PGS.TS. Nguyễn Thạch Tùng và các cộng sự [48]. Tiến hành như sau:
Tiến hành trên máy thử độ hòa tan:
- Thiết bị thử độ hòa tan Erweka - DT kiểu cánh khuấy - Môi trường thử: 500 ml môi trường đệm phosphat 6,8 - Tốc độ cánh khuấy: 100 vòng/phút
- Nhiệt độ: 37 ± 0,5ºC
Chuẩn bị dịch thử: 100 mg PGT hòa tan trong 5 ml methanol
Dịch thử này được thêm dần vào mơi trường hịa tan có chứa 500 ml dung dịch muối đệm phosphat pH 6,8 (có hoặc khơng có polyme), (mơi trường 1: khơng có gelatin (G), môi trường 2: 450 mg (G), môi trường 3: 900 mg (G), môi trường 4: 1800 mg (G)). Đánh giá kích thước tủa:
Sau các khoảng thời gian 2, 5, 10, 30, 60 phút, hút khoảng 25 ml phần dịch thử và thêm vào cốc đong của buồng đo HydroEV trên thiết bị Mastersizer 3000E sao cho độ che
23
khuất đạt 1-5%. Tiến hành đo mẫu ở 25 ºC, chỉ số khúc xạ RI là 1,542 và độ hấp thụ là 0,010 để xác định kích thước tủa trung bình.
Đánh giá mức độ siêu bão hòa:
Sau các khoảng thời gian 5, 15, 30, 45, 60, 120 phút, khoảng 5 ml phần dịch thử được rút ra và ly tâm ở máy ly tâm siêu tốc với tốc độ 15000 vòng/phút trong 3 phút.
Phần nổi phía trên thu được có chứa PGT được lọc qua màng 0,20 μm (Sartorius, Đức, Model Minisart RC 25) và định lượng bằng phương pháp HPLC. Mức độ siêu bão hòa (DS) của PGT trong dung dịch đệm pH 6,8 chứa gelatin ở các tỉ lệ khác nhau được tính bằng phương trình sau:
𝐷𝑆 = 𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑃𝐺𝑇 Độ ℎị𝑎 tan 𝑐â𝑛 𝑏ằ𝑛𝑔
Trong đó DS> 1 cho thấy trạng thái quá bão hòa, DS= 1 cho thấy trạng thái bão hòa và DS< 1 cho thấy trạng thái dưới bão hòa của PGT.
2.3.3.3. Đánh giá tương tác giữa gelatin và progesteron bằng phương pháp phổ hồng ngoại
Để xác định tương tác giữa gelatin và progesteron, tiến hành quét phổ hồng ngoại FT-IR với các mẫu: gelatin nguyên liệu, progesteron nguyên liệu, mẫu phối hợp dược chất và gelatin theo các tỉ lệ P:G là 1:4,5; 1:9 và 1:18.
Mẫu phối hợp được chuẩn bị bằng cách hòa tan gelatin trong nước cho trương nở và tan hoàn toàn ở nhiệt độ 65ºC trong 2 giờ, sau đó để nguội và phối hợp dung dịch này với dung dịch PGT trong methanol. Sấy khô bằng tủ sấy chân không với nhiệt độ 40 ºC và áp suất -0,08 mPa trong 48 giờ.
Nghiền khoảng 1 - 2 mg mẫu với 300 - 400 mg KBr tạo ra hỗn hợp đồng nhất, mịn. Đem hỗn hợp đó dập thành viên nén có đường kính 13 mm và lực dập khoảng 40N. Tiến hành quét phổ viên nén trên thiết bị FT - IR 6700 với số sóng từ 600 đến 4000 cm– 1 và kết quả được xử lý trên phần mềm Origin 2018.
2.3.4. Phương pháp đánh giá in vivo
2.3.4.1. Thiết kế mơ hình đánh giá sinh khả dụng trên thỏ
Chuẩn bị động vật thí nghiệm : Thỏ trắng giống đực trưởng thành (4-6 tháng tuổi)
có khối lượng 2 - 3 kg được ni trong phịng dược lý trường Đại học Dược Hà Nội.
Chuẩn bị mẫu thuốc: dịch nhân Utrogestan® 100 mg, SNEDDS 25 mg và nguyên liệu.
Tiến hành cho thí nghiệm song song: 11 con thỏ được chia làm 3 nhóm, sau đó
cho thỏ nhịn ăn 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm:
Nhóm 1: Uống hệ SNEDDS tương ứng 2,5 mg/kg PGT (n=3)
24
Nhóm 3: Uống nguyên liệu PGT tương ứng 10 mg/kg PGT (n=3)
Các mẫu thuốc được cho vào một nửa vỏ nang và gắn vào đầu ống xơng. Sau đó tiến hành đặt ống xơng đến dạ dày thỏ và bơm 10 ml nước để hoàn thành quá trình cho uống.
Lấy mẫu và xử lý huyết tương: Sau khi cho thỏ uống 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120,
180, 240, 360 phút tiến hành hút 2 ml máu thỏ cho vào ống có tráng EDTA. Ly tâm mẫu