CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp đánh giá in vivo
2.3.4.1. Thiết kế mơ hình đánh giá sinh khả dụng trên thỏ
Chuẩn bị động vật thí nghiệm : Thỏ trắng giống đực trưởng thành (4-6 tháng tuổi)
có khối lượng 2 - 3 kg được ni trong phịng dược lý trường Đại học Dược Hà Nội.
Chuẩn bị mẫu thuốc: dịch nhân Utrogestan® 100 mg, SNEDDS 25 mg và nguyên liệu.
Tiến hành cho thí nghiệm song song: 11 con thỏ được chia làm 3 nhóm, sau đó
cho thỏ nhịn ăn 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm:
Nhóm 1: Uống hệ SNEDDS tương ứng 2,5 mg/kg PGT (n=3)
24
Nhóm 3: Uống nguyên liệu PGT tương ứng 10 mg/kg PGT (n=3)
Các mẫu thuốc được cho vào một nửa vỏ nang và gắn vào đầu ống xơng. Sau đó tiến hành đặt ống xông đến dạ dày thỏ và bơm 10 ml nước để hồn thành q trình cho uống.
Lấy mẫu và xử lý huyết tương: Sau khi cho thỏ uống 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120,
180, 240, 360 phút tiến hành hút 2 ml máu thỏ cho vào ống có tráng EDTA. Ly tâm mẫu máu với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút. Thu huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ -10ºC trước khi đưa đi phân tích LC-MS/MS.
2.3.4.2. Phương pháp chiết QuEChERS
Phương pháp chiết đã được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát và lựa chọn trước đó [5]. Hút chính xác 500 µl huyết tương cho vào ống ly tâm 2 ml. Thêm 25 µl dung dịch nội chuẩn đồng vị progesteron-2,2,4,6,6,17α,21,21,21-d9 (PGT-d9) µg/ml và 475 µl acetonitril. Tiến hành lắc xốy trong vòng 1 phút để tạo hỗn hợp đồng nhất. Tiếp tục thêm 0,2 g MgSO4 và 0,05 g NaCl. Lắc xốy trong vịng 1 phút sau đó ly tâm với tốc độ 13000 vịng/phút trong vòng 10 phút. Hút lớp dịch lỏng trên cùng đưa đi định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS.
2.3.4.3. Phương pháp định lượng trong huyết tương bằng kỹ thuật LC-MS/MS
Phương pháp định lượng cũng đã được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát trước đó [4, 5]. Sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu đồng vị: progesteron-2,2,4,6,6,17α,21,21,21- d9 (PGT-d9). Tiến hành định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS với điều kiện MS như phụ lục 5 và điều kiện LC như sau:
+ Cột sắc ký: Agilent Eclipse XD8-C18 (3,0 x 150 mm), kích thước hạt nhồi 3,5 µm.
+ Thế tích tiêm: 10 µl. + Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
+ Chương trình dung mơi thể hiện ở bảng dưới đây:
Bảng 2.3. Chương trình dung mơi của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Thời gian (phút) Pha động
ACN (%) Dd acid formic 0,1% (%)
0,00 30,00 70,00 1,80 30,00 70,00 2,00 95,00 5,00 7,50 95,00 5,00 7,51 30,00 70,00 10,00 30,00 70,00
Thẩm tra lại độ tuyến tính, phương pháp xây dựng đường chuẩn định lượng PGT trong huyết tương thỏ tiến hành như sau:
25
Chuẩn bị dãy dung dịch chứa PGT chuẩn có nồng độ từ 2-2000 ng/ml và chuẩn nội PGT-d9 có nồng độ 50 ng/ml được pha loãng bằng dịch chiết huyết tương trắng. Dịch chiết huyết tương trắng được chuẩn bị bằng 0,5 ml acetonitril chiết với 0,5 ml huyết tương thỏ tại thời điểm 0 phút. Sau khi hỗn hợp đồng nhất được lắc xoáy 1 phút, dung dịch được chiết tách bằng 0,2 g MgSO4 và 0,05 g NaCl và lắc xoáy 1 phút. Hút lớp dịch trên pha loãng để thu được dãy dung dịch chuẩn. Tiến hành định lượng dãy dung dịch chuẩn bằng phương pháp LC-MS/MS.