CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học
2.3.1.1. Tởng hợp
- Dựa trên các nguyên tắc và phương pháp cơ bản trong hóa học hữu cơ để tiến hành tổng hợp các chất đã được thiết kế. Các phản ứng sử dụng bao gồm:
o Phản ứng ngưng tụ vòng quinazolin.
o Phản ứng alkyl hóa.
o Phản ứng hydrazid hóa.
o Phản ứng ngưng tụ imin.
- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (xác định thời điểm kết thúc phản ứng, độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế) và xác định nhiệt độ nóng chảy sau khi sản phẩm được tinh chế.
2.3.1.3. Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được
Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết sẽ được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C- NMR).
- Phổ hồng ngoại (IR): Được ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1. Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm. Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1.
- Phổ khối lượng (MS): Được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(-)-MS, dung môi MeOH.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): Được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic
19
của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K, dung môi DMSO-d6.
2.3.2. Đánh giá tác dụng sinh học các hợp chất tổng hợp được
2.3.2.1. Đánh giá đợc tính tế bào
Độc tính của 6 hợp chất được thử nghiệm tại khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Chúng được đánh giá thơng qua 3 dịng tế bào chính bao gồm tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế bào ung thư tiền liệt tuyến (PC3), và tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ ở người (NCI-H23). Các dòng tế bào này được mua từ ngân hàng tế bào tại Viện nghiên cứu Sinh học Hàn Quốc (KRIBB). Môi trường, huyết thanh và các thuốc thử khác sử dụng để nuôi cấy tế bào được nhận từ GIBCO Co. Ltd. (Grand Island, New York, Hoa Kỳ).
Cách tiến hành
Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) cho tới khoảng 3 x 104 tế bào/mL. Vào ngày 0, mỗi giếng trên đĩa chứa 96 giếng được cho vào 180 µL dịch tế bào rồi ủ trong môi trường CO2 5% ở 37°C trong vòng 24 giờ. Các phân tử tổng hợp được được hòa tan trong DMSO và pha lỗng tới nồng độ thích hợp bằng mơi trường ni cấy. Sau đó, 20µL mẫu trên được thêm vào từng giếng ở nồng độ khác nhau và tiếp tục ủ trong vịng 48 giờ. Độc tính của hợp chất đó được định lượng dựa trên phương pháp so màu.
Xử lí số liệu
Giá trị IC50 là giá trị nồng độ của chất mà tại đó ức chế 50% sự phát triển của tế bào. Kết quả cuối cùng là trung bình của 3 lần thử nghiệm độc lập với độ lệch chuẩn không quá 10%. Giá trị IC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 theo phương pháp Probits.
2.3.2.2. Đánh giá tác dụng hoạt hóa caspase-3
Tác dụng hoạt hóa caspase-3 của hợp chất Ve được thử nghiệm tại khoa Dược
trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc và được định lượng bằng bộ kit của Abcam theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Cách tiến hành
Tế bào ung thư hạch bạch huyết ở người (U937, nồng độ 5 x 105/mL mỗi giếng) được cấy vào đĩa 6 giếng và cho phát triển trong vòng 24 giờ. Các tế bào được xử lí cùng các hoạt chất (nồng độ 50 mM) trong 24 giờ, sau đó thu lại. Các tế bào thu được được rửa 2 lần với PBS lạnh và xử lí với đệm li giải đi cùng với bộ kit trên. Chất li giải tế bào (100 µ/50 µL) được trộn cùng với 50 µL đệm phản ứng 2x và 5µL DEVD-p- NA theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoạt tính được định lượng bằng phương pháp huỳnh quanh sau 1 giờ ủ.
20
2.3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào
Ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào được đánh giá với đại diện Ve trên dòng tế bào ung thư hạch bạch huyết ở người U937.
Cách tiến hành
Tế bào U937 (5x105/mL mỗi giếng) được nuôi cấy trong các đĩa 6 giếng và phát triển trong 24 giờ. Sau đó, tế bào được ủ với các chất (50 µM). Sau 24 giờ, tế bào được đem rửa bằng PBS băng, cố định bằng ethanol lạnh 75% và nhuộm bằng propidium iodid (PI) với sự có mặt của RNase ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Các tế bào đã nhuộm màu được phân tích hàm lượng ADN bằng máy đo tế bào dòng FACScalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
Xử lí số liệu
Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Cell Quest Pro (BD Biosciences).
2.3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng lên chu trình chết tự nhiên của tế bào
Dẫn chất Ve tiếp tục được đánh giá ảnh hưởng lên chu trình chết tự nhiên của tế bào với thuốc nhuộm kép Annexin V-FITC/PI.
Cách tiến hành
Tế bào ung thư hạch bạch huyết ở người U937 (5x105/mL mỗi giếng) được nuôi cấy trong các đĩa 6 giếng và phát triển trong 24 giờ. Các tế bào được ủ với các chất (50 µM) trong 24 giờ, và sau đó được thu hoạch. Các tế bào thu hoạch được rửa hai lần bằng PBS băng và ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 100 mL dung dịch đệm bám 1ì (binding buffer) cú cha 1 àL Annexin V-FITC v 12,5 mL PI. Sau khi ủ 15 phút, các tế bào được phân tích tỷ lệ phần trăm trải qua quá trình apoptosis bằng máy đo tế bào dịng FACScalibur (BD Biosciences).
Xử lí số liệu
21