- Đậu nành (Glycine soja)
2.3.3.2. Đánh giá độc tính của các mẫu nghiên cứu trên tế bào MCF-
Tách tế bào ra khỏi đĩa petri bằng 1ml trypsin - EDTA 0,25%, ủ trong tủ ấm 3 phút. Sau đó tế bào được đem ly tâm loại bỏ trypsin - EDTA. Tái hỗn dịch bằng 1ml môi trường nuôi cấy. Pha loãng hỗn dịch, tiến hành đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm tế bào Neubauer.
Sau khi đếm số lượng tế bào, tái phân bố tế bào trong 200μl môi trường nuôi cấy mới với mật độ 1 x 104 tế bào/giếng vào đĩa 96 giếng, nuôi cấy ở 37oC, 5% CO2/95% độ ẩm. Sau 24h, loại bỏ môi trường cũ, thay bằng 150μl môi trường DMEM + 10% FBS + 1% penicillin - streptomycin, đồng thời thêm vào mỗi giếng các nồng độ khác nhau của mẫu nghiên cứu.
Mỗi nồng độ được tiến hành thử nghiệm trên 3 giếng (lấy giá trị trung bình) và thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
Chuẩn bị mẫu thử:
• Pha dung dịch gốc cao chiết EtOH 70% Mạn kinh tử nồng độ 50 mg/ml trong DMSO. Từ nồng độ gốc này sẽ pha thành các nồng độ khác nhau: 50; 100 và 200µg/ml (pha trong mơi trường DMEM khơng có phenol + 5% huyết thanh thai bị đã được xử lý than hoạt) để đánh giá độc tính trên tế bào MCF-7.
• Pha dung dịch gốc hợp chất agnusid phân lập từ Mạn kinh tử nồng độ 2 mM trong DMSO. Từ nồng độ gốc này sẽ pha thành các nồng độ khác nhau: 5; 10 và 20 µM (pha trong mơi trường DMEM khơng có phenol + 5% huyết thanh thai bị đã được xử lý than hoạt) để đánh giá độc tính trên tế bào MCF-7
24
Tiếp tục ủ mẫu 24h, tiến hành đánh giá khả năng sống sót của tế bào bằng thử nghiệm MTT.
Thử nghiệm MTT:
• Nguyên tắc: đối với hầu hết các tế bào sống, hoạt động của ty thể là không đổi và do đó sự tăng hoặc giảm số lượng tế bào sống có liên quan tuyến tính với hoạt động của ty thể. Hoạt động của ty thể của tế bào được phản ánh bởi sự chuyển đổi MTT của muối tetrazolium (vàng) thành các tinh thể formazan (tím), có thể được hịa tan để đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm. MTT bị giảm tại các vị trí ubiquinon và cytochrom b và c của hệ thống vận chuyển điện tử ty thể và là kết quả của succinate dehydrogenase [88]. Đối với phép đo độ nhạy với mẫu nghiên cứu, giá trị OD của giếng có tế bào được ủ với thuốc được so sánh với OD của giếng có tế bào khơng tiếp xúc với thuốc [92].
Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng (tránh phân hủy MTT), loại bỏ 50μl môi trường cũ, đồng thời thêm 10μl dung dịch MTT 5 mg/ml vào mỗi giếng, ủ trong 3h ở 37oC, 5% CO2/95% độ ẩm. Sau đó loại bỏ mơi trường ni cấy tế bào và hịa tan formazan tạo thành bằng cách thêm vào mỗi giếng 200μl DMSO. Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm bằng máy đọc đĩa 96 giếng.
Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót. Lựa chọn những nồng độ khơng gây độc tính trên tế bào để đánh giá tác dụng tương tự estrogen cho thí nghiệm tiếp theo.
Thơng số đánh giá:
% tế bào sống = OD540của tế bào được xử lý
25