CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Các phương pháp đánh giá gel chứa nano SSD 1% (kl/kl)
2.3.5.1. Đánh giá về hình thức
Quan sát về thể chất, màu sắc, độ đồng nhất của gel bằng mắt thường.
2.3.5.2. Đánh giá pH
Cân khoảng 1g gel, pha lỗng 10 lần bằng nước cất, sau đó tiến hành đo pH bằng máy đo pH.
2.3.5.3. Định lượng hàm lượng dược chất trong gel
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Cách tiến hành:
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1 g gel vào bình định mức 50ml. Thêm khoảng 40ml dung dịch amonia 2,8%, đậy nắp và siêu âm trong 20 phút để hịa tan hồn tồn sulfadiazin bạc trong gel. Bổ sung dung dịch amonia 2,8% vừa đủ thể tích, lắc đều. Pha lỗng 1ml dung dịch trên thành 20ml bằng pha động, lắc đều, lọc qua màng lọc 0.45µm. Mẫu chuẩn: Chuẩn bị dung dịch chuẩn chứa SSD có nồng độ chính xác khoảng 10µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
Điều kiện sắc ký: tương tự như mục 2.3.2.2
Cơng thức tính tốn:
𝐻𝐿 = 𝑚𝑡𝑡 (𝑔𝑒𝑙)
𝑚𝑙𝑡 (𝑔𝑒𝑙) 𝑥 100% Trong đó:
18
mtt (gel): Lượng dược chất thực tế có trong gel (mg). mlt (gel): Lượng dược chất lý thuyết có trong gel (mg).
2.3.5.4. Đánh giá khả năng giải phóng dược chất qua màng khuếch tán
Lượng dược chất giải phóng qua màng của tiểu phân nano SSD được đánh giá qua lượng dược chất giải phóng qua màng cellulose acetat 0,45µm.
Qua tham khảo tài liệu, lượng SSD giải phóng qua màng được tiến hành ở các điều kiện cụ thể sau:
Điều kiện thử:
Thiết bị: Hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research.
Màng khuếch tán: Màng cellulose acetat (CA) 0,45µm. Trước khi thử, màng CA
được hoạt hóa bằng mơi trường giải phóng 30 phút.
Môi trường khuếch tán: đệm phosphat pH 7,4 (gồm có 2,38g Na2HPO4.12H2O,
0,19g KH2PO4 và 8g NaCl trong 1000 ml nước). Nhiệt độ thử: 37°C ± 0,5°C
Thể tích mơi trường: 7 ml, diện tích thử: 1,767 cm2 Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút
Khối lượng mẫu thử: 0,3 g gel
Cách tiến hành:
Mẫu thử: Tại thời điểm t=0, cân 0,3 g gel cho lên ngăn cho. Lấy mẫu ở các thời điểm
t=1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 và 24 giờ. Thể tích mỗi lần lấy mẫu là 2ml. Q trình lấy mẫu đồng thời cũng là q trình bổ sung mơi trường mới vào ngăn nhận với thể tích bằng thể tích mơi trường lấy ra. Lọc qua màng 0,45µm.
Mẫu chuẩn: Chuẩn bị dung dịch chuẩn chứa SSD có nồng độ chính xác khoảng
10µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
Xác định lượng dược chất giải phóng qua màng bằng phương pháp HPLC, từ đó xây dựng đồ thị thể hiện phần trăm dược chất giải phóng qua màng theo thời gian.
Cơng thức tính tốn:
Nồng độ SSD trong 2 ml mẫu lấy ra sau t giờ: 𝐶𝑡 = 𝑆𝑡
𝑆𝑐 𝑥 𝐶𝑐 ( 𝜇𝑔 𝑚𝑙) Khối lượng SSD trong 2 ml mẫu lấy ra sau t giờ:
𝑚𝑡 =𝑆𝑡
𝑆𝑐 𝑥 𝐶𝑐 𝑥 𝑘 𝑥 𝑉 (𝜇𝑔) Khối lượng SSD giải phóng tích lũy sau t giờ:
𝑀𝑡 = ∑ 𝑚𝑖 𝑡−1
𝑖=1
+ 𝐶𝑡 𝑥 7 (𝜇𝑔) Phần trăm dược chất giải phóng sau t giờ:
19 𝑋𝑡 = 𝑀𝑡
𝑀0 𝑥 100% Trong đó:
Sc, St: Diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử tại thời điểm t giờ (mAU.s) mi: Khối lượng SSD tại thời điểm thứ i (μg)
k: Hệ số pha lỗng
7: Thể tích mơi trường có trong ngăn nhận (ml) v: Thể tích lấy mẫu (2 ml)
Mo: Khối lượng SSD đưa lên thử (được tính theo phương pháp ở mục 2.3.5.3) (μg).
2.3.5.5. Xác định hình thái nano SSD trong gel (SEM)
Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử quét trên bề mặt mẫu nghiên cứu. Việc tạo ảnh được thực hiện thơng qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật [5].
Tiến hành: mẫu gel chứa nano SSD được đem đi đông khô rồi tiến hành chụp trên kính hiển vi điện tử quét Hitachi S4800 (Nhật Bản).
2.3.5.6. Đánh giá khả năng kháng khuẩn in-vitro
- Các chủng vi khuẩn sử dụng: Staphylococcus aureus (ATCC 25923) là một loại vi khuẩn gram dương và Escherichia coli (ATCC 25922) là một loại vi khuẩn gram âm.
- Các mẫu đánh giá: A - gel trắng, B – mẫu placebo, 1 - kem thị trường, 2 - gel chứa nano SSD, 3 - hỗn dịch nano và 4 - dung dịch dược chất.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
- MIC là nồng độ thấp nhất của thuốc có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. MIC được thực hiện bằng phương pháp vi pha lỗng trong mơi trường Muller Hinton Broth (CA-MHB) trên đĩa 96 giếng theo khuyến nghị của CLSI [16]. - Đánh giá sơ bộ cho thấy các mẫu A và B không ảnh hưởng đến các mẫu vi sinh
vật khi thực hiện phương pháp vi pha loãng.
- Các mẫu được pha trong nước, pha loãng liên tục theo cấp số 2 trong đĩa để có 100 µl dãy các nồng độ 128; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,025 mg/L trong CA- MHB, sau khi bổ sung vi sinh vật. Vi sinh vật được chuẩn bị trong môi trường PBS, nồng độ 0,5 McFarland, tương đương 108 vi khuẩn. Hỗn dịch được pha lỗng 100 lần để có 106 vi khuẩn trong CA-MHB, được hỗn dịch vi sinh vật làm việc. 100 µl hỗn dịch vi sinh vật làm việc được bổ sung vào các giếng trong đĩa. Đĩa được ủ 37°C trong 24h.
20
- Sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, môi trường TSA theo khuyến nghị của CLSI [16].
- Các mẫu A và B không gây ảnh hưởng đến các mẫu vi sinh vật theo phương pháp vi pha lỗng nên khơng thực hiện đánh giá vịng vơ khuẩn.
- Hỗn dịch vi sinh vật được chuẩn bị với nồng độ 0,5 McFarland (tương đương 108
vi khuẩn/ml) trong môi trường PBS vô khuẩn. Hỗn dịch vi sinh vật được tráng đều lên bề mặt thạch tương ứng sao cho nồng độ vi sinh vật trên đĩa thạch tương đương 106 vi khuẩn/ml. Thạch được để khơ hồn toàn. Đục thạch với que đục thạch chuyên dụng (0,6 mm) để tạo nên các giếng thạch. Các mẫu từ 1 đến 4 được chuẩn bị đến nồng độ làm việc 512 mg/L và 256 mg/L trong nước, sau đó nhỏ 50 µL vào mỗi giếng thử. Các mẫu được để trong tủ lạnh 3 giờ để các kháng sinh có thể khuếch tán, sau đó được ủ ở 37°C trong 24 giờ. Đường kính vịng vơ khuẩn được đo bằng thước Panme.