Nguyên lý của kỹ thuật được dựa trên nguyên lý của phản ứng ngưng kết. Nhóm máu hệABO được xác định bằng hai phương pháp là huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu: Phương pháp huyết thanh mẫu: sử dụng phân tử gel có gắn các kháng huyết thanh tương ứng chống A, chống B, chống D để xác định sự có mặt của kháng nguyên A, B và D trên bề mặt hồng cầu. Nếu có hiện tượng ngưng kết ở cột gel nào thì chứng tỏcó kháng nguyên tương ứng ở cột gel đó. Phương pháp hồng cầu mẫu: sử dụng hồng cầu A, hồng cầu B để xác định sự có mặt của kháng thể
chống A và kháng thể chống B trong huyết thanh. Nếu có hiện tượng ngưng kết ở
cột gel nào thì chứng tỏ có kháng thểtương ứng ở cột gel đó.
Trong hệ thống gel, sự ngưng kết xảy ra trong những microtube đặc biệt của GelCard bằng nhựa. Phương pháp ngưng kết cột gel được sử dụng để phát hiện phản ứng của kháng nguyên bề mặt hồng cầu và kháng thể trong microtube. Để
xét nghiệm xác định nhóm, dưới nhóm, Coomb trực tiếp, hồng cầu bệnh nhân pha loãng được nhỏ vào phần trên của microtube. Còn với xét nghiệm định nhóm bằng
phương pháp hồng cầu mẫu, sàng lọc và định danh kháng thể bất thường, hỗn hợp hồng cầu bệnh nhân, hay hồng cầu mẫu với huyết thanh, huyết tương bệnh nhân hay thuốc thửđược nhỏ vào microtube thích hợp. Trường hợp khơng có phản ứng, hồng cầu sẽ tự do lọt qua cột gel và tụ thành viên trịn ở đáy microtube. Trường hợp có phản ứng, hồng cầu ngưng kết bị cột gel giữ lại ở những mức độ khác nhau tùy thuộc vào mức độ ngưng kết. Cột gel đóng vai trị như cái sàng để tách hồng cầu ngưng kết với hồng cầu tự do. 50ml hồng cầu túi máu pha loãng bằng dung dịch LISS được nhỏ vào buồng phản ứng của microtube của card Coomb cùng với
19 25ml huyết thanh cần xét nghiệm. Hồng cầu pha loãng làm hàng rào ngăn cách
giữa gel và kháng thể trong huyết thanh. Huyết thanh khơng tiếp xúc trực tiếp với gel. Vì vậy khơng cần rửa như phương pháp truyền thống và bước rửa được loại bỏtrong giai đoạn Coombs. Sau khi ủ và ly tâm, hồng cầu tự do sẽ lọt qua cột gel và lắng dưới đáy microtube thành viên tròn nhỏ. Trong trường hợp có phản ứng, hồng cầu ngưng kết sẽ bị cột gel giữ lại.
Với độ chính xác cao cùng sự linh hoạt trong sử dụng, phương pháp Gelcard
vơ cùng hiệu quả trong việc định danh nhóm máu theo các hệ ABO và Rh; Kiểm tra phản ứng hòa hợp giữa máu bệnh nhân và túi máu; Sàng lọc, định danh kháng thể bất thường.
Định danh nhóm máu theo các hệ ABO, Rh bằng phương pháp Gelcard
Nguyên lý của kỹ thuật được dựa trên nguyên lý của phản ứng ngưng kết. Nhóm máu hệABO được xác định bằng hai phương pháp là huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu:
Phương pháp huyết thanh mẫu: sử dụng phân tử gel có gắn các kháng huyết
thanh (antiseria) tương ứng chống A, chống B, chống D đểxác định sự có mặt của kháng nguyên A, B và D trên bề mặt hồng cầu. Nếu có hiện tượng ngưng kết ở cột gel nào thì chứng tỏcó kháng nguyên tương ứng ở cột gel đó.
Phương pháp hồng cầu mẫu: sử dụng hồng cầu A, hồng cầu B đểxác định sự
có mặt của kháng thể chống A và kháng thể chống B trong huyết thanh. Nếu có hiện tượng ngưng kết ở cột gel nào thì chứng tỏ có kháng thểtương ứng ở cột gel
đó.
Vật tư sử dụng gồm:
- Thiết bị: Máy ly tâm chuyên dụng, máy ủ, máy đọc, pipet định chuẩn. - Vật tư: Giá cắm gelcard và ống nghiệm; Ống nghiệm thủy tinh: 12x75mm;
Cốc thuỷ tinh có mỏ loại 500 ml; Pipet nhựa; Bút maker; Gelcard (dùng
cho xác định hệ máu ABO, Rh); Dịch pha loãng; Hồng cầu mẫu.
- Mẫu bệnh phẩm: 2ml mẫu máu người bệnh được chống đông bằng EDTA hoặc citrat 3,8%.
20
Hình 1.3: Card định nhóm máu ABO và Rho(D) 1 phương pháp sử dụng huyết thanh mẫu (a), Card định nhóm máu 2 phương pháp huyết thanh mẫu và hồng cầu
mẫu (b) Thực hiện:
- Kiểm tra tồn bộ thơng tin bệnh nhân trên ống nghiệm cũng như phiếu yêu cầu định nhóm về: năm sinh, giới tính, số giường, chẩn đốn lâm sàng,
khoa phịng.
- Ghi đầy đủ thông tin của bệnh nhân lên ống nghiệm và phiến gelcard. - Hút 95µl dung dịch ID-Diluent 2 vào ống nghiệm được ghi tên ở trên. - Hút 5µl hồng cầu bệnh nhân cần định nhóm vào ống nghiệm trên. - Trộn đều nhẹ nhàng.
- Mở tấm bảo vệ phủ lên các cột gel theo đúng quy định.
- Hút 10 – 12,5µl hồng cầu bệnh nhân 5% nhỏ lần lượt vào các giếng được in sẵn anti-A, anti-B, anti-D và control.
- Hút 10 – 12,5µl hồng cầu mẫu A, B nhỏ lần lượt vào các giếng được in sẵn A1, B
- Hút 25µl huyết thanh của bệnh nhân nhỏ lần lượt vào các giếng chứa hồng cầu mẫu A, B và control.
- Dán lại tấm bảo vệ phủ lên các cột gel.
- Ly tâm 1000 vòng/ phút x 10 phút bằng máy ly tâm chuyên dụng. - Đọc và báo cáo kết quả.
Các mức độ ngưng kết sẽ được máy đọc kết quả nhận định theo các mức độ
sau: 4 + Các hồng cầu ở phía trên cùng của cột gel. 3 + Hầu hết các tế bào hồng cầu đỏ vẫn còn ở nửa trên của cột gel. 2 + Tế bào hồng cầu được quan sát trong
21 suốt chiều dài của cột. Một ít nhóm hồng cầu cũng có thể được hiển thị ở dưới cùng của cột gel. 1 + Hầu hết các hồng cầu ở nửa dưới của cột. Một sốcũng có thể được hiển thịởdưới cùng của cột gel. Âm tính, tất cả các tếbào máu đỏđi qua và
tạo thành một nút nhỏ gọn ở phía dưới của gel. Phản ứng pha trộn, có hai quần thể hồng cầu: một trên bề mặt gel, một quần thể khác lắng đọng ở đáy gel. Hình
1.4 mơ tả trực quan các mức độngưng kết tại các cột Gelcard.
Hình 1.4 Mức độngưng kết có thểthu được tại các cột Gelcard [2] Đọc kết quảđịnh danh nhóm máu hệ ABO, Rh sử dụng card định nhóm máu 2 phương pháp huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu:
• Đọc kết quả nhóm máu hệ ABO:
Bảng 1.4 Kết quảđịnh danh nhóm máu hệ ABO sử dụng Gelcard [3] Anti-A Anti-B Hồng cầu A Hồng cầu B Nhóm máu
3+ đến 4+ Âm tính Âm tính 3+ đến 4+ A
Âm tính 3+ đến 4+ 3+ đến 4+ Âm tính B
3+ đến 4+ 3+ đến 4+ Âm tính Âm tính AB
Âm tính Âm tính 3+ đến 4+ 3+ đến 4+ O
• Đọc kết quả nhóm máu hệ Rh(D):
Bảng 1.5 Kết quảđịnh danh nhóm máu hệ Rh(D) sử dụng Gelcard [3]
3+ đến 4+ 1+ đến 2+ Âm tính
Rh(D) dương tính Rh(D) dương tính yếu Rh(D) âm
Kết quả kết luận của xét nghiệm với Card định danh nhóm máu hệ ABO, Rh
theo phương pháp huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu sẽ là kết hợp của Nhóm máu chỉ thị và Nhóm D Rh chỉ thị.
22
Một số xét nghiệm khác sử dụng phương pháp Gelcard
a) Xét nghiệm kiểm tra phản ứng hòa hợp giữa máu bệnh nhân và túi máu Huyết tương hoặc huyết thanh người bệnh được ủở 37OC với hồng cầu người cho, nếu kháng thể hiện diện trong huyết tương hoặc huyết thanh của người bệnh
tương ứng với kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu thì sẽ có hiện tượng hấp phụ
kháng thể lên bề mặt hồng cầu, các kháng thểnày thường là kháng thể miễn dịch IgG. Khi ly tâm các hồng cầu này sẽđi xuống lớp gel chứa anti IgG, nếu có sự gắn các kháng thể vào hồng cầu ởgiai đoạn ủ thì sau khi ly tâm các hồng cầu sẽđược giữ lại ở trên bề mặt cột gel hoặc trong cột gel. Nếu khơng có sự gắn kháng thể thì các hồng cầu tự do sẽ vượt qua lớp gel và lắng đọng ở đáy microtube. Tương tự như vậy trong môi trường enzyme nếu có hiện tượng kết hợp kháng nguyên của
người cho và kháng thể của người nhận thì hồng cầu sẽđược giữ lại trên bề mặt hoặc trong cột gel.
Vật tư sử dụng:
- Thiết bị: Máy ly tâm chuyên dụng, máy ủ, máy đọc, pipet định chuẩn. - Vật tư: Giá cắm gelcard và ống nghiệm; Ống nghiệm thuỷ tinh: 12x75mm;
Cốc thuỷ tinh có mỏ loại 500 ml; Pipet nhựa; Bút maker; Gelcard (dùng cho kiểm tra phản ứng hòa máu); Dịch pha loãng; Hồng cầu mẫu.
- Mẫu bệnh phẩm: 2ml mẫu máu người bệnh được chống đông bằng EDTA hoặc citrat 3,8%.
Hình 1.5 Gelcard sử dụng để kiểm tra sự hòa hợp máu Thực hiện [3]: