Kí hiệu mẫu Khả năng trung hịa gốc tự do (SC, %) IC50 (mg/mL) Chứng (+) [axit ascorbic] 86,53 ± 0,3 0,0126 Chứng (-) [DPPH/EtOH+ DMSO] 0,0 0,0 - CCG5 14,55 0,0 >5 CCG 10 15,45 0,5 4,87 CCG 15 19,59 0,4 4,51 CCG 20 20,99 0,6 4,35 GCM1 76,89 ± 0,8 0,49
Kết quả phân tích (Bảng 3.10) cho thấy thấy chiết xuất GCM1 có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn so với hạt nano tổ hợp CCG. Sự giảm hoạt tính chống oxy hóa của hạt nano tổ hợp CCG so với chiết xuất α-mangostin ban đầu khoảng 10 lần có thể là do hàm lượng của GCM1 trong vi hạt thấp, chỉ dao động từ 5 đến 20% trọng lượng các polyme. Khi tăng hàm lượng chiết xuất GCM1 trong các vi hạt CCG, hoạt tính chống oxy hóa của chúng cũng tăng lên tuy nhiên qua kết quả này cho thấy với liều lượng nghiên cứu thì khả năng chống oxy hóa của các hạt tổ hợp CCG là không cao, cần tăng lượng chiết xuất tải trong mẫu hạt nếu muốn gia tăng hoạt tính chống oxy hóa của nó.
108
3.5.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các hạt tổ hợp CCG
Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng các vi sinh vật kiểm định của chiết xuất α- mangostin (GCM1) và các hạt tổ hợp CCG được trình bày trong Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của hạt nano tổ hợp CCG và chiết xuất α-mangostin (GCM1)
Tên mẫu (µg/mL) Giá trị
% ức chế các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định
Gram (+) Gram (-) Nấm men
Staphylococc us aureus Bacillus subtilis Lactobacillus fermentum Salmonell a enterica E. Coli Pseudomonas aeruginosa Candida albicans CCG5 128 100 100 100 0 0 0 0 32 40 0 5 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 IC50 48.00 80.00 77.47 >128 >128 >128 >128 MIC 128 128 128 >128 >128 >128 >128 CCG 10 128 100 100 100 0 0 0 0 32 100 50 0 0 0 0 0 8 30 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 IC50 14.86 32.00 80.0 >128 >128 >128 >128 MIC 32 128 128 >128 >128 >128 >128 CCG 15 128 100 100 95 0 0 0 0 32 95 100 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 IC50 20.63 20.00 82.53 >128 >128 >128 >128 MIC 128 32 >128 >128 >128 >128 >128 CCG 20 128 100 100 98 0 0 0 0 32 92 74 0 0 0 0 0 8 10 25 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 IC50 19.71 20.25 80.98 >128 >128 >128 >128 MIC 128 128 >128 >128 >128 >128 >128 GCM1 256 100 100 100 0 10 20 0 64 100 100 100 0 0 0 0 16 100 100 100 0 0 0 0 4 100 100 100 0 0 0 0 1 55 40 0 - - - - 0.33 20 0 0 - - - - IC50 0.89 1.5 2.5 >256 >256 >256 >256 MIC 4 4 4 >256 >256 >256 >256
IC50 là giá trị nồng độ chất thử ức chế 50% lượng vi sinh vật kiểm định, MIC là giá trị nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật kiểm định.
Kết quả này chỉ ra rằng cả chiết xuất α-mangostin (GCM1) và các hạt tổ hợp CCG có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm nghiệm tốt, có thể ức chế các chủng vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus
fermentum). Tuy nhiên cả hai đều không thể ức chế các chủng Gram (-) (Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) và nấm men (Candida albican) ở nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 và MIC của các hạt nano tổ hợp CCG
109
cao hơn so với chiết xuất GCM1 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các hạt tổ hợp CCG kém hơn so với chiết xuất α-mangostin ban đầu GCM1. Điều này có thể là do hàm lượng GCM1 trong vi hạt CCG thấp (5 ÷ 20% trọng lượng polyme) và chất nền là các polyme có hoạt độ kháng khuẩn thấp. Khi tăng hàm lượng chiết xuất GCM1 trong các mẫu, hoạt tính kháng khuẩn của các hạt nano tổ hợp CCG trở nên mạnh hơn.
3.5.8.3. Độc tính tế bào vero của vi hạt CCG
Kết quả thử hoạt tính gây độc và ức chế sự tăng sinh tế bào dòng Vero (Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi) được thực hiện theo phương pháp MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] được trình bày trên bảng 3.12.
Bảng 3.12. Độc tính tế bào vero của chiết xuất α-mangostin (GCM1) và các hạt nano tổ hợp carrageenan, chitosan và α-mangostin (CCG)
Mẫu Nồng độ, (µg/mL) Tỷ lệ ức chế tế bào (%) IC50 (µg/mL) GCM1 25 99,98 ± 1,04 2,68 5 63,21 ± 0,56 1 42,55 ± 0,32 CCG 5 100 17,45 ± 0,33 >100 50 10,50 ± 0,54 25 7,11 ± 0,67 CCG 10 100 9,83 ± 0,22 >100 50 6,72 ± 0,14 25 3,33 ± 0,09 CCG 15 100 29,82 ± 0,19 >100 50 11,89 ± 0,45 25 7,78 ± 0,34 CCG 20 100 38,85 ± 0,67 >100 50 19,95 ± 0,42 25 10,03 ± 0,98
Quan sát Bảng 3.12 cho thấy GCM1 gây độc trên tế bào vero ở nồng độ 25 μg/mL (tỷ lệ tế bào bị tức chế đạt 99,98%), trong khi đó các mẫu hạt tổ hợp CCG khả năng gây độc và ức chế tế bào vero đã giảm xuống. Khi tăng hàm lượng GCM1, tỷ lệ ức chế tế bào vero của các mẫu hạt tổ hợp CCG được tăng lên. Ví dụ, ở nồng độ mẫu thử 100 μg/mL, tỷ lệ ức chế tế bào của các mẫu CCG 5, CCG 10, CCG15 và CCG 20 lần lượt là 17,45%, 9,83%, 29,82 5 và 38,85%. Chiết xuất GCM1 có IC50 là 2,68 μg/mL. Các vi hạt CCG không gây độc cho tế bào vero ở
110
nồng độ thử nghiệm có IC50>100 μg/mL. Kết quả này cho thấy hỗn hợp carrageenan và chitosan khi tải α-mangostin đã giúp làm giảm độc tính tế của chiết xuất này do các polyme này khơng độc và tương thích sinh học tốt, do đó, tải GCM1 bằng sự pha trộn carrageenan và chitosan là cần thiết
Đánh giá hoạt tính của các hạt tổ hợp CCG cho thấy với hàm lượng α- mangostin được tải vào dao động từ 5 ÷20% (so với khối lượng của các poyme) thể hiện hoạt tính chống oxy hố yếu, nhưng lại có hoạt tính kháng các vi khuẩn Gram (+) như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Lactobacillus fermentum, đồng thời khơng gây độc tế bào thường dịng Vero ở nồng độ ≤100 µg/mL. Điều này cho thấy các hạt nano tổ hợp CCG có thể đưa vào thực phẩm với liều lượng gợi ý <100 µg/mL như một chất kháng vi sinh vật và tăng cường khả năng chống oxy hoá cho sản phẩm.
Trên cơ sở đánh giá các hoạt tính cũng như đặc tính của hạt nano tổ hợp trên cho thấy: 2 polyme carrageenan và chitosan dung nạp tốt chiết xuất α-mangostin (hiệu suất tải α-mangostin đều >90%); kích thước hạt giao động trong khoảng 43÷1106 nm, trong đó các hạt CCG10 có tỷ lệ các hạt kích thước nano nhỏ cao nhất (chiếm gần 15%); tất cả các hạt CCG đều thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Lactobacillus fermentum mạnh và không gây độc tế bào thơng thường dịng Vero ở mức nồng độ ≤100 µg/mL, khả năng hoà tan α-mangostin của các hạt tổ hợp tốt hơn so với α-mangostin tự do ban đầu trong các dung dịch có pH khác nhau.
Dữ liệu trên cho thấy tiềm năng ứng dụng các tổ hợp CCG trong các sản phẩm thực phẩm nhằm phát huy khả năng kháng vi sinh vật, đối với thực phẩm dạng lỏng nên lựa chọn các thực phẩm chứa cồn. Trong số các cơng thức hạt nano tổ hợp thì CCG5 thể hiện hoạt tính và khả năng hồ tan tốt nhất, tiếp đến là tổ hợp CCG15 và CCG10. Tuy nhiên, quan sát tiến trình giải phóng α-mangostin (Hình 3.31) cho thấy mặc dù tổ hợp CCG10 giải phóng α-mangostin hạn chế hơn so với tổ hợp CCG5, 15 trong các dung dịch pH 1,2 và 4,5 nhưng giải phóng tốt hơn trong dung dịch pH 6,8 (đây là môi trường dịch vị của đại tràng, nơi thức ăn lưu lại lâu nhất trong cơ thể, điều đó cho thấy cơ hội hoạt chất sẽ được hấp thu tốt hơn. Ngoài ra, để hạn chế đưa thêm nhiều chất mang polyme vào thực phẩm, chúng tôi đã lựa chọn tổ hợp CCG10 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.6. Nghiên cứu sử dụng chiết xuất măng cụt trong sản xuất một số sản phẩm thực phẩm số sản phẩm thực phẩm
Chúng tôi lựa chọn 3 sản phẩm giò và rượu vang, rượu màu để bước đầu khảo sát ứng dụng một số chiết xuất măng cụt và hạt nano tổ hợp CCG. Trong đó, giị là sản phẩm đại diện cho dịng sản phẩm dạng rắn, sản phẩm này hiện nay chủ yếu sản xuất thủ công, sản xuất và tiêu thụ tại chỗ hầu hết sử dụng trong thời gian ngắn (vài ngày); Các sản phẩm rượu vang và rượu màu là những sản phẩm chứa một lượng
111
cồn nhất định, dự báo sẽ có khả năng hoà tan tốt hơn đối với các chiết xuất măng cụt đặc biệt là α-mangostin và hạt tổ hợp CCG và có thể phát huy được cả các ưu điểm về hoạt tính cũng như màu của các chiết xuất này đối với sản phẩm bổ sung.
3.6.1. Nghiên cứu ứng dụng chiết xuất măng cụt trong sản xuất giò
Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu hoạt tính của các chiết xuất thu được từ vỏ quả măng cụt kết hợp với những đặc tính cũng như xác định/dự đoán thành phần của mỗi chiết xuất và đặc trưng của sản phẩm giị, chúng tơi đã lựa chọn và tính tốn hàm lượng các chiết xuất bổ sung vào sản phẩm giò. Các chiết được lựa chọn trong thử nghiệm bổ sung vào sản phẩm giị bao gồm: Chiết xuất cơ đặc (giảm 60% dung mơi) (SPL1), cặn nước (cả hai chiết xuất này có thể chứa các nhóm chất màu, có thể làm tăng sác hồng của thịt tạo ra màu đỏ cho sản phẩm), chiết xuất α- mangostin và hạt nano tổ hợp CCG10 (với mong muốn phát huy các hoat tính chống oxy hoá, kháng khuẩn, ... cho sản phẩm).
Sản phẩm giị sau đó được đánh giá thông qua chỉ tiêu về màu sắc và hàm lượng vi sinh vật tổng số.
Các kết quả phân tích vi sinh vật và đo màu của các mẫu giò được thể hiện trong bảng 3.13, 3.14 và hình 3.32.
1 2 3 4 5 6
Hình 3.32. Hình ảnh lát cắt đo màu các mẫu giị
1- Bổ sung 0,5% dịch chiết cô đặc (SPL1), 2- Bổ sung 1,5% dịch chiết cô đặc (SPL1), 3- Bổ sung 0,01% α-mangostin (GCM1), 4- Bổ sung 0,01% hạt nano tổ
hợp (CCG10), 5- Bổ sung 0,6% cao nước và 6- Mẫu đối chứng
Phân tích dữ liệu đo màu bằng hệ thống đo màu và xử lý ảnh (computer vision) (Bảng 3.13) và vi sinh vật hiếu khí tổng số (Bảng 3.14) cho thấy: Các mẫu bổ sung dịch chiết cơ đặc (SPL1) khơng có sự khác biệt về độ sáng (L) và sắc vàng (b) của giò so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên cường độ màu hồng (a) lại có xu hướng giảm so với mẫu đối chứng Mẫu bổ sung chiết xuất α-mangostin (GCM1) với liều lượng 10,5 mg/100 g giị khơng có sự khác biệt về các giá trị đo màu (L, a và b), như vậy việc bổ sung 10,5 mg GCM1 không làm làm thay đổi độ sáng và màu sắc của giò. Mẫu bổ sung hạt tổ hợp CCG10 với hàm lượng 10,8 mg/100g giị có các giá trị đo màu a thấp hơn, b cao hơn và L tương đương với mẫu đối chứng, chứng tỏ sự có mặt của hạt nano tổ hợp CCG10 không làm thay đổi độ sáng của
112
giò, làm giảm sắc tố hồng và tăng sắc vàng cho giò. Sự tác động màu sắc này có thể do trong hạt tổ hợp chứa chiết xuất α-mangostin, hợp chất này có màu vàng sáng, vì vậy sự có mặt của nó làm cho sắc vàng của giị tăng lên, kéo theo giảm sắc tố màu hồng của thịt. Mẫu bổ sung 61,6 mg cao nước vào 100 g giị có các giá trị đo màu L, a và b đều không thể hiện sự khác biệt, cho thấy việc bổ sung chiết xuất này không ảnh hưởng tới màu sắc và độ sáng của giò.
Bảng 3.13. Đánh giá tác động của các chiết xuất tới màu sắc của giò sau 12 giờ bảo quản lạnh dưới 10oC
STT Loại chiết xuất bổ sung vào 100 g giò
Hàm lượng
(%)
Giá trị L Giá trị a Giá trị b
1 Chiết xuất cô đặc (SPL1) 0,5 80,67 ± 2,06ab -5,89 ± 0,18b 26,28 ± 0,85a
2 Chiết xuất cô đặc (SPL1) 1,5 80,67 ± 0,38ab -5,95 ± 0,64b 26,53 ± 0,15a
3 α-mangostin (GCM1) 0,01 81,17 ± 0,27ab -4,43 ± 0,09c 27,01 ± 0,37a
4 Hạt nano tổ hợp (CCG10) 0,01 82,50 ± 0,63b -7,77 ± 0,63a 28,51 ± 0,22b
5 Cặn nước 0,6 79,97 ± 0,58a -4,09 ± 0,36c 26,66 ± 0,30a
6 Mẫu đối chứng 0 81,99 ± 0,09ab -4,74 ± 0,55c 25,77 ± 0,97a
Bảng 3.14. Tổng số vi sinh vật hiếu khí trên mẫu giị có bổ xung các chiết xuất măng cụt sau 120 giờ bảo quản lạnh ở nhiệt độ <10oC
STT Loại chiết xuất bổ sung vào 100 g giò
Hàm lượng
(%)
Tổng số VSV hiếu khí (CFU/mL)
1 Chiết xuất cơ đặc (SPL1) 0,5 700
2 Chiết xuất cô đặc (SPL1) 1,5 200
3 α-mangostin (GCM1) 0,01 20
4 Hạt nano tổ hợp (CCG10) 0,01 50
5 Cặn nước 0,06 200
6 Mẫu đối chứng 0 1,1 x 104
Tất cả các mẫu có bổ sung chiết xuất măng cụt đều có mật độ vi sinh vật hiếu khí tổng số thấp hơn rất nhiều so với mẫu đối chứng (không bổ sung chiết xuất), điều này cho thấy sự có mặt của các chiết xuất trong giị có khả năng kháng các vi
113
sinh vật hiếu khí. Mật độ vi sinh vật hiếu khí trong mẫu giị thường cao hơn gấp 550 lần mẫu giò chứa 0,01% α-mangostin (GCM1), 220 lần đối với mẫu bổ sung 0,01% chiết xuất hạt nano tổ hợp (CCG10), 55 lần mẫu giò chứa 0,06% cặn nước, 55 lần với mẫu chứa 1,5% chiết xuất cô đặc (SPL1) và 1,57 lần so với mẫu bổ sung 0,5% chiết xuất cô đặc (SPL1).
Như vậy, với thử nghiệm bổ sung các chiết xuất như GCM1, hạt nano tổ hợp CCG10 và cặn nước không làm ảnh hưởng tới độ sáng của giò, làm giảm sắc tố hồng của thịt và tăng sắc tố vàng cho sản phẩm giò (đối với chiết xuất hạt tổ hợp và chiết xuất cô đặc), đã cải thiện khả năng kháng vi sinh vật (đặc biệt với GCM1 và hạt nano tổ hợp CCG10 mật độ vi sinh vật hiếu khí tổng số thấp hơn 550 và 220 lần so với mẫu đối chứng), điều này gợi ý cho việc có thể sử dụng các chiết xuất măng cụt như là một chất bảo quản đối với sản phẩm giò.
3.6.2. Nghiên cứu ứng dụng chiết xuất măng cụt trong sản xuất rượu vang nho đỏ và rượu màu vang nho đỏ và rượu màu
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn chiết xuất α-mangostin (GCM1) và hạt nano tổ hợp để bổ sung vào sản phẩm rượu trắng và rượu vang nho Ninh Thuận với mong muốn thu được sản phẩm:
- Từ rượu trắng tạo ra sản phẩm rượu màu giàu α-mangostin
- Từ rượu vang rượu vang nho Ninh Thuận thu được rượu vang giàu α- mangostin và ít bị biến đổi về màu sắc của rượu.
Hàm lượng chiết xuất α-mangostin (GCM1) và hạt nano tổ hợp CCG10 được tính tốn dựa trên đánh giá về hoạt tính và độc tính với tế bào thường dịng Vero, đánh giá sản phẩm dựa vào hàm lượng polyphenol tổng số theo TCVN 9745-1:2013 và cường độ màu bằng phương pháp quang phổ UV-Vis [152]. Kết quả thể hiện trên bảng 3.17 và Hình 3.28.
Quan sát các số liệu trên bảng 3.15 cho thấy hàm lượng polyphenol của tất cả các mẫu rượu có bổ sung các chiết xuất α-mangostin và hạt nano tổ hợp CCG cao hơn so với các mẫu khơng bổ sung chiết suất.
Phân tích các chỉ số màu cho thấy, cường độ màu chung I của các mẫu rượu bổ sung α-mangostin và hạt nano tổ hợp CCG10 hầu hết cao hơn so với mẫu rượu khơng bổ sung chứng tỏ sự có mặt của các chất này đã làm cho sản phẩm có màu đậm hơn. Chỉ số H lớn hơn 1 nhiều kết hợp với giá trị Y cao hơn nhiều lần so với các giá trị R và B đã chỉ ra tất cả các sản phẩm rượu bổ sung α-mangostin và hạt nano tổ hợp CCG10 đều có thiên hướng phát triển màu vàng.
Bảng 3.15. Chỉ số màu sắc và hàm lượng polyphenol của các sản phẩm rượu bổ sung hạt nano tổ hợp CCG10 và chiết xuất α-mangostin sau 10 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng
114
Tên sản phẩm Chiết xuất
Hàm lượng chiết xuất (g/100mL) Polyphenol (mgGAE/mL) I H Y (%) R (%) B (%)
Rượu trắng (Mẫu đối chứng) 0,001 - - - - - Rượu GCM1 GCM1 0,010 0,132 1,27 5,72 81,10 14,17 4,72 Rượu CCG10 CCG10 0,510 0,104 1,45 9,00 86,90 9,66 3,45 Vang nho đỏ Ninh Thuận (Mẫu đối
chứng) 0,343 1,01 2,79 66,34 23,76 9,90
Vang nho đỏ
GCM1 GCM1 0,051 0,440 1,03 3,04 67,96 22,33 9,71