Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Bố trí thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Nghiên cứu phân lập một số hoạt chất
Quy trình phân lập các hoạt chất từ vỏ quả măng cụt được mơ tả trong Hình 2.6.
Hình 2.6. Quy trình tách và phân lập các hoạt chất từ vỏ quả măng cụt
- Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu bột vỏ quả măng cụt được trích ly theo chế độ đã lựa chọn để thu được dịch trích chứa các hoạt chất sinh học. Dịch trích ly được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng. Hòa cao tổng vào nước cất và chiết lần lượt bằng các dung mơi có độ phân cực khác nhau n-hexane,
37
ethylacetat, n-butanol, … với lượng dung mơi thích hợp, lặp lại quá trình chiết 3 lần với mỗi loại dung môi để thu được dịch chiết các phân đoạn. Sau đó cất loại dung mơi dịch chiết các phân đoạn thu được các cặn tương ứng (ví dụ như cặn n-hexan, cặn ethyl acetate, cặn n-butanol, cặn nước, …). Các hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh học đặc biệt nhóm xanthon trong đó có α-mangostin được dự đoán phân bổ chủ yếu trong phân đoạn ethy acetate, do đó cặn cặn ethyl acetate được lựa chọn để tiếp tục chiết, phân tách nhiều lần bằng sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi khác nhau như CH2Cl2:MeOH, n- Hexan:EtOAc, …, tỷ lệ các dung môi được thay đổi nhằm phân tách được các hoạt chất [55, 80, 135-142].
Để phân tách các chất sử dụng các loại cột sắc kí với kích cỡ khác nhau: Sắc ký cột thường (silica gel cỡ hạt 197-400 mesh (0,040-0,063 mm) cho cột đầu); Sắc ký cột nhanh (silica gel cỡ hạt 70-200 mesh cho cột tiếp theo); Sắc ký cột pha đảo (RP-18); Sắc ký lọc gel (Sephadex LH-20 (Merck)). Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc,
MeOH được cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng.
Sắc ký lớp mỏng: Phương pháp sắc ký này được sử dụng trước và sau mỗi phương pháp sắc ký khác nhằm lựa chọn dung mơi thích hợp để tiến hành tách sắc ký và để phân tích sơ bộ thành phần các dịch chiết cũng như các hợp phần thu được. Các phân đoạn được pha với ethanol ở nồng độ 20 mg/mL. Tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 với kích thước 7 × 3 cm với các hệ dung môi khác nhau. Sau khi dung môi chạy đến vạch kẻ trên bản mỏng, lấy bản mỏng ra khỏi cốc đựng dung môi, làm khô và soi trên máy quang phổ. Dùng chất hiện màu (dung dịch H2SO4 10%) phun đều trên mặt bản mỏng rồi sấy khơ đến khi hiện màu. Sau đó, soi bản mỏng trong máy soi ở 3 bước sóng 365 nm, 302 nm và 254 nm để phát hiện tiếp các hợp chất có thể phát quang và 365nm, sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 (vanilin 1,2 g; MeOH 200 mL; CH3COOH 25 mL; H2SO4 11 mL). - Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được:
Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy Spectrum Two, hãng Perkin Elmer (Mỹ); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 [499,84 MHz (1H) và 125 MHz (13C); TMS (δ = 0,0); CD3OD (δ = 49,0); CDCl3 (δ=77,0)]; Phổ khối ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL và máy AMD 402 (Đức); Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-MS Varian (USA).
Điểm chảy được đo bằng máy đo điểm chảy VEB Analytik Dresden HMK 73/4470 (Đức).
Năng suất quay cực được đo trên thiết bị Jasco P-2000 Polarimeter serial A060161232.
38