CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tác dụng và cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ của hương nhu tía
3.1.1. Tác dụng và cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn tồn
hương nhu tía (OS) trên mơ hình chuột nhắt bị loại bỏ thùy khứu giác (OBX)
3.1.1.1. Tác dụng của cao OS lên trí nhớ nhận diện vật thể của chuột OBX
Thử nghiệm nhận diện đồ vật (ORT) đã được sử dụng để làm sáng tỏ tác động của OS đối với trí nhớ nhận diện vật thể, một loại trí nhớ làm việc khơng liên quan đến khơng gian (non-spacial working memory) trên chuột OBX (Hình 3.1.).
Hình 3.1. Ảnh hưởng của cao OS lên trí nhớ làm việc của chuột OBX trong
thử nghiệm nhận diện vật thể ORT.
(A) Sơ đồ thử nghiệm ORT; (B) Thời gian khám phá vật thể O1, O2 giai đoạn luyện tập; (C) Thời gian khám phá vật thể O1, O3 giai đoạn kiểm tra (*p < 0,05 khi so sánh thời gian khám phá vật thể mới O3
với thời gian khám phá vật thể tương tự O1, n = 9-12) (so sánh giá trị trung bình ± SEM, kiểm định paired Student’s t-test)
các lơ chuột sinh lý, bệnh lý và các lơ chuột điều trị bằng cao OS và DNP là khơng cĩ sự khác biệt (p > 0,05) (Hình 3.1B.).
Ở giai đoạn kiểm tra, kết quả được trình bày ở Hình 3.1C. như sau:
- Lơ chứng sinh lý cĩ thời gian khám phá vật thể mới O3 dài hơn đáng kể so với thời gian khám phá vật thể tương tự O1 (p = 0,011 < 0,05).
- Lơ chuột OBX khơng được điều trị cĩ thời gian khám phá vật thể mới và vật thể tương tự khơng cĩ sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê, chứng tỏ chuột OBX đã bị suy giảm trí nhớ nhận diện vật thể (p = 0,291 > 0,05).
- Chuột OBX được điều trị bằng DNP (1,5 mg/kg/ngày, i.p) đã dành nhiều thời gian hơn đáng kể để khám phá đối tượng mới O3 so với đối tượng quen thuộc O1 (p = 0,016 < 0,05), chứng tỏ DNP cĩ tác dụng cải thiện suy suy giảm trí nhớ nhận diện vật thể trên chuột OBX.
- Điều trị hàng ngày bằng OS (liều 200 và 400 mg/kg/ngày, p.o) cho tác dụng cải thiện trí nhớ nhận diện vật thể trên chuột OBX phụ thuộc liều. Ở liều thấp 200 mg/kg, tác dụng kéo dài thời gian khám phá vật thể mới của OS trên chuột OBX khơng đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,507 > 0,05). Trong khi OS 400 mg/kg làm tăng rõ rệt thời gian khám phá vật thể mới O3 so với vật thể tương tự O1 (p = 0,013 < 0,05).
Như vậy, kết quả này cho thấy OS ở mức liều 400 mg/kg/ngày cĩ tác dụng cải thiện sự suy giảm trí nhớ làm việc khơng liên quan đến khơng gian do OBX gây ra, tương tự với tác dụng của chứng dương DNP ở liều 1,5 mg/kg/ngày.
3.1.1.2. Tác dụng của OS lên trí nhớ khơng gian ngắn hạn của chuột OBX
Thử nghiệm mê lộ chữ Y nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ làm việc liên quan đến khơng gian (spatial working memory) của cao OS trên chuột OBX. Kết quả được biểu diễn dưới dạng biểu đồ cột trong Hình 3.2.
Trong giai đoạn kiểm tra, kết quả thể hiện ở Hình 3.2B như sau:
- Tỷ lệ thời gian mà lơ sinh lý dành để khám phá cánh mới B ở giai đoạn kiểm tra so với thời gian khám phá hai cánh quen thuộc A, C chiếm xấp xỉ 50%, cao hơn mức cơ hội (xác suất để chuột vào 1 trong 3 cánh ngẫu nhiên là 33,3%), chỉ ra sở thích ưa mới lạ hơn là quen thuộc của lồi gặm nhấm.
- Chuột OBX khơng được điều trị cĩ tỷ lệ thời gian khám phá cánh mới chỉ ngang mức cơ hội, ngắn hơn đáng kể so với lơ sinh lý (p = 0,013 < 0,05), cho thấy mất đi thùy khứu giác làm chuột bị suy giảm trí nhớ làm việc liên quan đến khơng gian.
- Điều trị bằng DNP (1,5 mg/kg/ngày) đã kéo dài đáng kể thời gian khám phá cánh mới của chuột OBX so với lơ bệnh lý khơng được điều trị (p = 0,034 < 0,05), chứng tỏ DNP cĩ tác dụng ngăn chặn sự suy giảm trí nhớ khơng gian ngắn hạn trên chuột OBX.
- Điều trị hàng ngày bằng OS (liều 200 và 400 mg/kg/ngày, p.o) cho tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian ngắn hạn trên chuột OBX phụ thuộc liều. Thời gian khám giá cánh mới của chuột được điều trị bằng OS liều 200 mg/kg cĩ xu hướng kéo dài hơn nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê so với lơ bệnh lý (p = 0,085 > 0,05). OS liều 400 mg/kg đã làm tăng thời gian khám phá cánh mới trên chuột OBX cao hơn rõ rệt so với lơ bệnh lý (p = 0,038 < 0,05)
- Như vậy, OS ở mức liều 400 mg/kg/ngày cĩ tác dụng cải thiện trí nhớ làm việc liên quan đến khơng gian của chuột OBX, tương tự với DNP ở liều 1,5 mg/kg/ngày.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của cao OS lên trí nhớ khơng gian ngắn hạn của chuột OBX
trong thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến.
(A) Sơ đồ thử nghiệm mê lộ chữ Y cải tiến; (B) Tỷ lệ phần trăm khám phá cánh mới B của các lơ trong giai đoạn kiểm tra (*p < 0,05 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p < 0,05 khi so sánh các
lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n = 9-12).
(one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s). 3.1.1.3. Ảnh hưởng của cao OS lên sự giãn não thất bên của chuột OBX
Nghiên cứu tiến hành khảo sát tác động đến tình trạng giãn não thất bên do OBX gây ra cũng như ảnh hưởng của việc sử dụng lâu dài OS và chất ức chế
cholinesterase DNP trên chuột OBX. Kết quả được chỉ ra trong Hình 3.3.
Hình 3.3. Tỷ lệ mở rộng não thất bên của các lơ
(A) Hình ảnh chụp tiêu bản não chuột ở vị trí ≈−1.46 mm so với vùng bregma quan sát dưới kính hiển vi, mũi tên chỉ khoảng rỗng ở não thất; (B) Đồ thị biểu diễn tỷ lệ diện tích não thất bên trên tổng diện tích não (*p < 0,05 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh
lý, n=3-5). (one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).
0,006 < 0,01), chứng tỏ việc loại bỏ thùy khứu giác đã gây ra hiện tượng giãn não thất bên ở chuột.
- Lơ chuột OBX được điều trị bằng DNP 1,5 mg/kg/ngày cĩ tỷ lệ giãn não thất bên ít hơn lơ bệnh lý nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,693 > 0,05).
- Ở liều thấp 200 mg/kg/ngày, cao OS khơng ảnh hưởng đáng kể đến kích thước não thất bên của chuột OBX (p = 0,693 > 0,05). Tuy nhiên, ở mức liều 400 mg/kg, cao OS đã làm giảm hơn 50% kích thước não thất bên so với chuột OBX khơng được điều trị (p = 0,023 < 0,05).
Như vậy, OBX gây giãn rộng não thất bên ở chuột và điều trị lâu dài bằng OS liều 400 mg/kg/ngày cho thấy tác dụng ngăn chặn đáng kể tình trạng mở rộng não thất bên do OBX gây ra, trong khi thuốc ức chế cholinesterase DNP liều 1,5 mg/kg/ngày khơng thể hiện rõ tác dụng này.
3.1.1.4. Ảnh hưởng của cao OS đến sự tăng sinh tế bào thần kinh mới vùng hồi hải mã trên chuột OBX
Nghiên cứu đánh giá mức độ ảnh hưởng của OBX đến quá trình hình thành thần kinh mới ở hồi hải mã, cũng như tác động của cao OS và DNP lên quá trình này đã được tiến hành, sử dụng chỉ dấu doublecortin (DCX) - chỉ dấu của tế bào thần kinh mới sinh. Bằng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch với kháng thể kháng DCX, số lượng tế bào dương tính với DCX (tế bào DCX – bắt màu nâu) trong vùng hồi răng (dentate gyrus) của hồi hải mã trong các lơ chuột nghiên cứu được đếm và so sánh. Kết quả được trình bày ở Hình 3.4 như sau:
- Số lượng tế bào DCX đã giảm đáng kể ở lơ chuột OBX so với lơ sinh lý (p = 0,044 < 0,05), chứng tỏ cĩ sự suy giảm quá trình hình thành tế bào thần kinh hồi hải mã ở chuột OBX.
- Trong khi đĩ, lơ chuột OBX sử dụng DNP (1,5 mg/kg/ngày) cĩ số lượng tế bào DCX cao hơn rõ rệt so với lơ chuột OBX khơng được điều trị (p = 0,035 < 0,05). Tương tự, lơ chuột OBX được uống OS liều 400 mg/kg/ngày cĩ số lượng tế bào DCX cao hơn đáng kể so với lơ chuột OBX khơng được điều trị (p = 0,019 < 0,05).
Như vậy, điều trị bằng OS 400 mg/kg/ngày và DNP 1,5 mg/kg/ngày đã cải thiện rõ rệt tình trạng suy giảm hình thành tế bào thần kinh mới ở hồi hải mã chuột do OBX gây ra.
Hình 3.4. Số lượng tế bào dương tính với DCX ở vùng hồi răng hồi hải mã của các lơ
(A) Hình ảnh chụp tiêu bản não chuột quan sát dưới kính hiển vi, Scale bar = 100 μm, bregma ≈ −1.70 mm, mũi tên chỉ các tế bào dương tính DCX bắt màu nâu; (B) Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào
dương tính với DCX (*p < 0,05 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý, n=4-5). (one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).
3.1.1.5. Ảnh hưởng của cao OS lên số lượng tế bào dương tính với cholin acetyltransferase (ChAT) của vùng vách giữa (media septum) trong não chuột OBX
Nhằm tìm hiểu cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ của cao OS thơng qua hệ cholinergic, bằng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch sử dụng kháng thể ChAT (enzym tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin), số lượng tế bào dương tính với ChAT (tế bào ChAT – bắt màu nâu) vùng vách giữa của chuột OBX đã được đếm và so sánh giữa các lơ nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở Hình 3.5.
- Chuột OBX khơng được điều trị cĩ số lượng tế bào ChAT giảm gần 50% so với chứng sinh lý (p = 0,002 < 0,01), chứng tỏ cĩ sự suy giảm rõ rệt tế bào cholinergic trong não chuột.
- Chuột OBX được điều trị bằng DNP liều 1,5 mg/kg/ngày cĩ số lượng tế bào ChAT nhiều hơn đáng kể so với lơ bệnh lý khơng được điều trị (p = 0,017 < 0,05).
- Chuột OBX được điều trị bằng OS liều 200 mg/kg/ngày cĩ số lượng tế bào ChAT cao hơn chuột OBX khơng được điều trị, tuy nhiên sự khác biệt chưa đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,103 > 0,05). OS với mức liều cao 400 mg/kg/ngày đã làm tăng rõ rệt số lượng tế bào ChAT trên chuột OBX (p = 0,022 < 0,05).
Như vậy, OBX đã gây suy giảm số lượng tế bào ChAT vùng vách giữa và OS ở mức liều 400 mg/kg/ngày cũng như DNP liều 1,5 mg/kg/ngày cĩ tác dụng cải thiện tình trạng suy giảm chức năng hệ cholinergic này trên chuột OBX.
3.1.1.6. Ảnh hưởng của cao OS đến hoạt độ của enzym acetylcholinesterase (AChE) ở vỏ não chuột OBX
Cũng trên hệ cholinergic, để tìm hiểu cơ chế tác dụng cải thiện trí nhớ của OS cĩ thơng qua việc ức chế hoạt độ AChE (enzym thủy phân acetylcholin), từ đĩ làm tăng acetylcholin nội sinh não tương tự DNP hay khơng, hoạt độ enzym AChE trong vỏ não chuột đã được đánh giá trên ex vivo.
Kết quả ở Hình 3.6. chỉ ra rằng:
- Hoạt độ enzym AChE vỏ não của lơ sinh lý và lơ OBX khơng được điều trị khơng cĩ sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,152 > 0,05).
- Hoạt độ enzym AChE vỏ não của các lơ chuột OBX được điều trị bằng DNP thấp hơn đáng kể so với lơ bệnh lý khơng được điều trị (p = 0,046 < 0,05).
Hình 3.5. Số lượng tế bào dương tính với ChAT ở vách giữa của các lơ
(A) Hình ảnh chụp tiêu bản não chuột quan sát dưới kính hiển vi, Scale bar = 50μm, bregma ≈ +0.98mm (2-3 lát cắt não/1 chuột), mũi tên chỉ các tế bào dương tính với ChAT bắt màu nâu; (B) Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào dương tính với ChAT (**p < 0,01 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p
< 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý, n = 3-4). (one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).
- OS ở mức liều thấp 200 mg/kg cĩ xu hướng làm giảm hoạt độ enym AChE trong não chuột nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Tuy nhiên, ở mức liều OS 400 mg/kg, hoạt độ enzym AChE trong não chuột đã thấp hơn rõ rệt so với lơ bệnh lý (p = 0, 037 < 0,05).
Như vậy, OS liều 400 mg/kg/ngày, đường uống cho thấy tác dụng ức chế enzym AChE ex vivo hiệu quả tương tự với thuốc chứng dương DNP liều 1,5
mg/kg/ngày.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của cao OS đến hoạt độ enzym AChE trong vỏ não chuột OBX
ex vivo
(#p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n=5-7). (one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s). 3.1.1.7. Ảnh hưởng của cao OS lên tín hiệu VEGF vùng hồi hải mã
Nghiên cứu cho thấy, cĩ mối liên kết chặt chẽ giữa hệ cholinergic và tín hiệu VEGF trong não, gĩp phần bảo vệ thần kinh và chống lại chứng sa sút trí tuệ [27, 167]. Do đĩ, nghiên cứu tiến hành đánh giá ảnh hưởng của OS lên biểu hiện gen VEGF và VEGFR2 vùng hồi hải mã của chuột OBX, sử dụng kỹ thuật Real time PCR. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện gen VEGF được chỉ ra trong Hình 3.7A. như sau:
- Mức độ biểu hiện gen của VEGF trong hồi hải mã chuột OBX bị giảm rõ rệt so với lơ sinh lý (p = 0,047 < 0,05).
VEGF cao hơn đáng kể so với chuột OBX khơng được điều trị (p = 0,018 < 0,05) - Chuột OBX được uống OS liều 400 mg/kg/ngày cĩ biểu hiện gen VEGF tăng lên rõ rệt so với lơ bệnh lý (p = 0,033 < 0,05).
Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện gen VEGFR2 được chỉ ra trong Hình 3.7B. như sau:
- Mức độ biểu hiện gen của thụ thể VEGFR2 trong hồi hải mã chuột OBX bị giảm đáng kể so với lơ sinh lý (p = 0,029 < 0,05).
- Chuột OBX được điều trị bằng OS 400 mg/kg/ngày và DNP 1,5 mg/kg/ngày đều khơng làm thay đổi đáng kể biểu hiện của VEGFR2 so với lơ bệnh lý (p = 0,239 > 0,05).
Hình 3.7. Ảnh hưởng của OS lên mức độ biểu hiện gen VEGF và VEGFR2 trong hồi
hải mã chuột OBX sử dụng kỹ thuật Real time PCR: (A) biểu hiện gen VEGF; (B) biểu hiện gen VEGFR2
Mức độ biểu hiện của các gen đích được hiệu chuẩn (normalization) theo mức độ biểu hiện của β- actin trước khi đem so sánh giữa các lơ chuột (*p < 0,05 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p <
0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n=6-7). (one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).
Để tìm hiểu mức độ biểu hiện gen VEGF cĩ tương đồng với mức độ biểu hiện protein hay khơng, biểu hiện của protein VEGF trong hồi hải mã đã được xác định bằng kỹ thuật Western blot (WB).
Kết quả ở Hình 3.8. cho thấy:
- Lơ bệnh lý OBX đã giảm đáng kể biểu hiện protein VEGF trong hồi hải mã khi so sánh với lơ chứng sinh lý (p = 0,007 < 0,01).
- Ở chuột OBX được điều trị bằng OS (400 mg/kg/ngày) cũng như DNP (1,5 mg/kg/ngày), biểu hiện protein VEGF đã tăng lên đáng kể so với chuột OBX khơng được điều trị (tương ứng p = 0,019; p = 0,022 < 0,05).
Hình 3.8. Ảnh hưởng của OS lên biểu hiện protein VEGF trong hồi hải mã chuột dùng
phương pháp Western blot
(A) Hình ảnh đại diện của phân tích dữ liệu WB; (B) Đồ thị phân tích so sánh mức độ biểu hiện protein VEGF. Mức độ biểu hiện của các protein đích được hiệu chuẩn (normalization) theo mức
độ biểu hiện của β-actin trước khi đem so sánh giữa các nhĩm chuột nghiên cứu (**p < 0,01 khi so sánh lơ sinh lý với lơ bệnh lý, #p < 0,05 khi so sánh các lơ thuốc với lơ bệnh lý OBX, n=5).
(one-way ANOVA, hậu kiểm Student-Newman-Keul’s).
Như vậy, cĩ sự suy giảm đáng kể yếu tố VEGF trong hồi hải mã chuột OBX bao gồm sự suy giảm biểu hiện gen VEGF, VEGFR2 và biểu hiện protein VEGF. Cả OS (400 mg/kg/ngày) và DNP (1,5 mg/kg/ngày) đều cho thấy tác dụng cải thiện rõ rệt
tình trạng suy giảm biểu hiện VEGF nhưng khơng cĩ ảnh hưởng đáng kể đến biểu hiện gen VEGFR2.