Chuyên đề 2: Khảo sát phổ huỳnh quang của bức xạ các LED phổ dụng vớ

CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN

2.2. Chuyên đề 2: Khảo sát phổ huỳnh quang của bức xạ các LED phổ dụng vớ

với bƣớc sóng từ vùng cực tím cho đến vùng hồng ngoại gần với mô và da 2.2.1. Niêm mạc miệng

a) Đối tƣợng nghiên cứu.

* Cấu trúc giải phẫu niêm mạc miệng [15].

Khoang miệng được phủ bởi loại biểu mô lát được gọi là niêm mạc miệng. Niêm mạc miệng có thể được chia thành hai lớp chính là biểu mơ và lớp mô đệm nằm dưới (chứa chủ yếu là mơ liên kết).

Hình 2.2.1. Giải phẫu học mơ miệng.

Biểu mơ: trong khoang miệng có nguồn gốc từ phơi ngoại bì và lát phân tầng.

Hầu hết bề mặt niêm mạc miệng được lót bởi biểu mô lát tầng không sừng hoá, ngoại trừ nướu, hard palate, và bề mặt lưng lưỡi (được bao phủ bởi biểu mô lát tầng sừng hóa).

Biểu mơ lát tầng khơng sừng hóa gồm những tế bào đã biệt hóa, có ít keratin.

Các hàng tế bào ở lớp ngồi cùng cịn nhân, bao gồm 4 lớp (từ trên xuống): lớp bề mặt, lớp trung gian, lớp tế bào gai (spinosum) và màng đáy. Màng đáy lại chia làm 2 lớp là lớp đáy (basale) và lớp lưới. Trong một số trường hợp, người ta gọi 2 lớp trên là màng đáy đôi, phân biệt với màng đáy đơn chỉ gồm lớp đáy.

28

Biểu mơ lát tầng sừng hóa gồm các tế bào lớp trên đã biệt hóa, nhiều keratin.

Các hàng tế bào ở lớp ngoài cùng khơng cịn nhân. Biểu mơ lát tầng sừng hóa cũng có bốn lớp tương tự biểu mô lát tầng khơng sừng hóa nhưng khác hai lớp ngoài cùng, bao gồm: lớp sừng hóa, lớp hạt (granlosum), lớp tế bào gai và màng đáy đôi.

Mô đệm được tạo bởi mô liên kết. Mô liên kết tạo mô nền kết gắn và liên kết

các tế bào và cơ quan lại với nhau. Vì thế, lớp đệm có vai trị nâng đỡ biểu mô và kết gắn biểu mơ với mơ kế cận. Vùng có biểu mơ và lớp đệm có thể hình thành các nhú (papilla). Chiều dài của nhú thay đổi theo vị trí và các yêu cầu chức năng. Sự gia tăng về số lượng và chiều dài của nhú được nhìn thấy trong khu vực cần sự bám dính giữa biểu mơ và mơ đệm.

Nhu cầu trao đổi chất của biểu mô phải thông qua mô đệm. Các axit amin, peptide, carbon-hydrate, các hợp chất vô cơ và muối cần thiết cho dinh dưỡng nhờ sự khuếch tán từ mao mạch qua mô liên kết và màng đáy để đi vào biểu mơ. Ngồi các nguyên bào sợi, tế bào máu, hệ bạch huyết và dây thần kinh, các tế bào khác cũng được tìm thấy trong mơ đệm.

Trong hầu hết các khu vực của miệng thì khơng có sự xuất hiện của submucosa, nó có chức năng như là một phần đính kèm của mơ đệm. Nó là một thành phần của mô liên kết bao gồm các tế bào và các yếu tố nội bào. Nó được tìm thấy ở má, mơi và các phần của khẩu cái. Nó chứa rất nhiều mạch máu, dây thần kinh và hệ bạch huyết và chức năng của nó là bảo vệ và dinh dưỡng. Tầng dưới niêm mạc cũng là vị trí có chứa các mơ mỡ và các tuyến nước bọt nhỏ trong khoang miệng. Trong khu vực xương khơng có submucosa, các sợi của mô đệm gắn chặt vào xương. Niêm mạc và mô đệm trong các khu vực này thường được gọi là mucoperiosteum.

* Tính chất quang học niêm mạc miệng.

Để khảo sát phổ huỳnh quang của niêm mạc miệng, ta cần nghiên cứu về tính chất phát quang của các thành phần cấu tạo nên niêm mạc miệng. Từ đó có thể chọn bước sóng thích hợp cho thiết bị soi vòm miệng sử dụng kỹ thuật quang học.

Một số chất phát quang (fluorophore) nội sinh có cư ờng độ mạnh nhất tồn tại trong con người và động vật có liên quan đến sự chuyển hóa tế bào. Loại chiếm ưu

29

thế trong thể loại này bao gồm các dạng rút go ̣n c ủa nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), các flavins khác nhau (FAD), và lipopigments có tính huỳnh quang ma ̣nh (ví dụ: lipofuscin và ceroids). Ngồi những loại này, nhiều fluorophore nội sinh khác tồn tại, phát ra phát xạ củ a những vù ng phổ khác nhau trong vùng t ử ngoại và vù ng khả kiến của quang phổ điện từ. Những fluorophore này bao gồm các chất thơm , các acid amin như tryptophan , tyrosine, phenylalanine, các po rphyrins khác nhau (hemoglobin, myoglobin, vv), và trong một số trường hợp và vị trí, huỳnh quang porphyrin màu đ ỏ là do vi khuẩn [26,27].

Các dẫn xuất của nucleotide và flavin là các chất phát huỳnh quang chính chịu trách nhiệm cho sự phát huỳnh quang của tế bào và chúng đóng vai trị quan trọng trong sự trao đổi chất nội bào. Nicotinamide adenine dinucleotide là chất nhận electron chính trong sự phốt pho hoá của ti lạp thể và dạng rút gọn của nó là NADH có tính huỳnh quang, có cực đại kích thích và phát xạ tương ứng là 360 nm, 450 nm. Khi NADH bị dính vào enzyme trong màng ti lạp thể nó có cực đại phát xạ ở 470 nm.

Flavin adenine dinucleotide là một chất nhận electron khác nữa và dạng oxi hố của nó, FAD, có tính huỳnh quang, có cực đại kích thích và cực đại phát xạ là 450 nm và 530 nm. Qua các nghiên cứu về ma trận kích thích phát xạ huỳnh quang của mơ cổ tử cung (một loại mơ có cấu trúc niêm mạc khá giống niêm mạc miệng) các tác giả thấy rằng các chất chỉ thị trao đổi chất NADH và FAD là các nguồn gốc chính phát huỳnh quang tế bào ở kích thích 350 nm và 450 nm (tương ứng cho từng loại). Do đó phổ huỳnh quang có thể được sử dụng để tìm những thay đổi trong các trạng thái trao đổi chất của tế bào (được đánh giá bởi nồng độ NADH và FAD) [27].

Một nguồn phát huỳnh quang khác trong tế bào là các sợi tế bào sừng, tập trung xung quanh nhân và màng tế bào của các tế bào biểu mơ. Ma trận kích thích – phát xạ của móng tay người (chứa chủ yếu là keratin) cho thấy kích thích từ 350- 400 nm đều có đỉnh là 430 nm.

Loại chất phát huỳnh quang nữa liên quan đến huỳnh quang biểu mơ là porphyrin. Chất này là thành phần chính của hemoglobin, myoglobin và cytochrome nó được hình thànhh bởi sự hợp nhất của các nguyên tử sắt vào protoporphyrin IX.

30

Bước sóng kích thích – phát xạ đối với porphyrin là 490-630 nm, huỳnh quang porphyrin thường có màu đỏ, đỏ cam. Huỳnh quang đỏ có thể thấy bình thường trên sàn lưỡi và ở cao răng. Trong giai đoạn ung thư, đôi khi ung thư cũng phát huỳnh quang đỏ (cho thấy có sự có mặt của porphyrin), nhưng nguồn gốc porphyrin ở đây vẫn chưa chắc chắn (chỉ là sự suy luận). Có một giả thuyết được ủng hộ nhất đó là huỳnh quang đỏ này là sản phẩn của sự nhiễm vi khuẩn [28]. Các ảnh hiển vi của các mẫu ni của cổ tử cung khi có loạn sản thể hiện huỳnh quang của biểu mơ ở kích thích 360 nm thì tăng, trong khi đó, huỳnh quang của mơ đệm thì giảm. Nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng huỳnh quang của tế bào chất bị giới hạn đối với một lớp mỏng của tế bào mầm, trong khi phần cịn lại của biểu mơ phát huỳnh quang chủ yếu từ các tế bào periphery.

Từ những kết quả nghiên cứu trên ta thấy rằng hầu hết các chất phát quang có trong mô niêm mạc miệng đều phát quang ở vùng khả kiến khi bị kích thích bởi ánh sáng tử ngoại gần. Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã chọn mơ phỏng phổ huỳnh quang của niêm mạc miệng với bước sóng kích thích là 365 nm.

b) Phƣơng pháp nghiên cứu.

* Mô phỏng huỳnh quang Monte Carlo.

Đề tài sử dụng phương pháp mô phỏng huỳnh quang Monte Carlo để nghiên cứu quá trình phát xạ huỳnh quang từ một mơi trường đục có chứa một hỗn hợp các chất phát huỳnh quang cần xem xét. Xét một xung ánh sáng ngắn ở bước sóng ex chiếu vng góc vào bề mặt mơ, quãng đường photon kích thích được mô phỏng lan truyền trong mơi trường cho đến khi nó thốt ra tại các biên hoặc bị hấp thụ. Khi nó được hấp thụ bởi các chất phát huỳnh quang trong mơ, nó sẽ phát ra một photon huỳnh quang có bước sóng em. Photon huỳnh quang lan truyền qua môi trường và bị hấp thụ hoặc phát ra ở bề mặt (bỏ qua sự tái hấp thụ của các chất phát huỳnh quang dẫn tới sự phát xạ thứ 2).

Các tính chất quang học của môi trường mô được miêu tả bởi hệ số hấp thụ µa, hệ số tán xạ µs, hệ số bất đẳng hướng g, hiệu suất huỳnh quang hiệu dụng , chiết

suất tỉ đối của môi trường đục với môi trường xung quanh. Các hệ số này thay đổi phụ thuộc vào bước sóng kích thích và bươc sóng phát xạ huỳnh quang.

31

Ở đây chúng tôi sử dụng chương trình mơ phỏng nhiều lớp được phát triển bởi nhóm nghiên cứu tại phịng thí nghiệm máy tính vật lý thuộc trường đại học Lund [29]. Sự khác biệt giữa mơ phỏng huỳnh quang và mơ phỏng MC bình thường đó là khi ánh sáng bị hấp thụ, nó sẽ phát ra một photon huỳnh quang, khi đó ta sẽ phải theo dõi sự lan truyền của photon đó. Photon này bị thay đổi so với photon kích thích (bước sóng của photon bị dịch chuyển về phía đỏ theo định luật Stoke), điều này làm cho các tính chất quang học của mơ đối với photon cũng bị thay đổi.

Thành phần cấu trúc mô lưỡi khá giống với những phần còn lại trong miệng ngoại trừ nướu và khẩu cái. Cấu trúc niêm mạc mô lưỡi và các thông số quang học như hệ số hấp thụ, hệ số tán xạ, chiết suất, hệ số bất đẳng hướng ứng với mỗi bước sóng được trích từ [30]. Mơ hình niêm mạc miệngsử dụng trong mô phỏng được chia thành 5 lớp: biểu mô bề mặt (surperficial epithelium), biểu mô trung gian (intermediate epithelium), biểu mô đáy (basal epithelium), mô đệm bề mặt (superficial stroma), mô đệm sâu (deep stroma) [26].

Bảng 2.2.1. Cấu trúc niêm mạc mô lưỡi và các thông số quang học [30].

Lớp Độ dày (µm) μa (cm-1) μs (cm-1)

Biểu mô bề mặt (SE) 80 4 197

Biểu mô trung gian (IE) 80 4 65

Biểu mô đáy (BE) 120 4 178

Mô đệm bề mặt (SS) 125 13 311

Mô đệm sâu (DS) 20000 13 311

* Phƣơng pháp ảnh huỳnh quang.

Trong nghiên cứu này, bên cạnh sử dụng phương pháp mô phỏng để tạo tiền đề cho việc khảo sát sự phát quang của các lớp mơ và lựa chọn nguồn kích thích phù hợp cho mơ hình thiết bị, chúng tôi đã xây dựng mơ hình thực nghiệm là hệ quang học chụp ảnh huỳnh quang nhằm lựa chọn các linh kiện quang học có thơng số phù hợp cho việc kích thích và chụp ảnh huỳnh quang của niêm mạc miệng.

32

Ảnh huỳnh quang là một phương pháp đơn giản nhưng đạt hiệu quả cao trong tầm sốt, chẩn đốn sớm các bệnh về vịm họng, miệng… đặc biệt là ung thư vịm họng. Do các mơ có cấu trúc khác nhau, thành phần cấu tạo cũng khác nhau, khi có các biểu hiện bệnh, hình ảnh huỳnh quang sẽ xuất hiện nhiều điểm bất thường. Từ đó xây dựng được một cơ sở dử liệu nền chuẩn, tạo cơ sở cho việc đánh giá các biểu hiện bất thường.

Hệ quang học dùng trong việc quan sát trực quan ánh sáng huỳnh quang phát ra từ mô miệng bao gồm: đèn LED được nối với nguồn (bước sóng của LED được xác định từ chương trình mơ phỏng MC), kính lọc UV bandpass UG-1 (Edmund) được đặt sau đèn LED cho phép một dải ánh sáng cần thiết truyền qua, chặn ánh sáng vùng khả kiến của đèn LED gây nhiễu sự phát quang từ mô miệng, một kính lọc longpass (51290, 51292 Newport Corp.) được đặt trước mắt người quan sát hoặc camera chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang đi qua, nhằm tăng khả năng quan sát (hình 2).

Hình 2.2.2. Hệ quang học chụp ảnh huỳnh quang mơ miệng.

c)Kết quả.

* Kết quả mô phỏng.

Như đã đề cập ở trên, ánh sáng kích thích có bước sóng 365 nm có khả năng kích thích huỳnh quang tất cả các thành phần phát quang (NADH, FAD, collagen) có trong các lớp niêm mạc miệng (tính đến độ sâu của lớp bề mặt mô đệm). Mặt khác, công nghệ chế tạo đèn LED hiện nay chỉ cho phép tạo ra những nguồn sáng có bước sóng nhất định, trong đó có 365 nm. Do đó, chúng tơi đã tiến hành mô phỏng đề tìm ra phổ huỳnh quang của niêm mạc miệng dưới ánh sáng kích thích 365 nm.

33

Phổ huỳnh quang của các phân lớp mô niêm mạc miệng thu được sau mơ phỏng được biểu diễn trong hình 2.2.3.

Hình 2.2.3. Sự phân bố phổ huỳnh quang của mơ niêm mạc miệng khi được kích

thích bằng bước sóng 365 nm sau khi chạy mơ phỏng.

Từ hình 2.2.3 ta thấy, mặc dù bị kích thích bởi cùng một bước sóng 365 nm, nhưng mỗi lớp cho phổ huỳnh quang có cường độ và vị trí khác nhau (bảng 2.2.2). Ngoại trừ lớp mô đệm sâu DS không phát quang (do độ sâu của lớp này quá lớn so với độ xuyên sâu ánh sáng), các lớp còn lại đều phát quang ở vùng ánh sáng khả kiến.

Bảng 2.2.2. Vùng phát quang và đỉnh phổ của các lớp khi được mơ phỏng với

bước sóng 365 nm.

Phân lớp SE IE BE SS

Vùng phổ(nm) 360 - 530 460 - 590 360 - 580 360 – 540

Đỉnh phổ (nm) 445 525 465 425

Cần chú ý rằng, hai thành phần phát huỳnh quang NADH và FAD phân bố ở ba lớp trên cùng (SE, IE, BE); còn collagen and elastin crosslinks nằm ở hai lớp dưới (SS, DS). Do đó, phổ huỳnh quang của mỗi lớp là sự tổng hợp phổ của các thành phần phát quang có mặt trong lớp đó. Ngồi ra, phổ huỳnh quang của mỗi lớp chịu sự chi phối rất lớn của hai yếu tố sau: sự tái hấp thụ năng lượng bức xạ của các

34

thành phần phát quang trong mỗi lớp; sự hấp thụ bức xạ huỳnh quang của hemoglobin. Ở yếu tố đầu tiên, có thể dễ dàng nhận thấy NADH phát huỳnh quang ở 450 nm trùng với bước sóng hấp thụ của FAD. Collagen crosslinks có nhiều loại, loại bức xạ tại 420 nm (khi bị kích thích bởi 355 nm) đến lượt mình trở thành nguồn kích thích cho một loại crosslinks khác bức xạ ở 475 nm…Ngoài sự tái hấp thụ của fluorophores, sự hấp thụ của haemoglobin ảnh hưởng khá mạnh lên phổ huỳnh quang ở mỗi lớp. Hemoglobin có đỉnh hấp thụ mạnh gần 420 nm hai dải hấp thụ yếu hơn xuất hiện ở oxy-hemoglobin gần 540 và 580 nm. Một đỉnh hấp thụ của deoxy-hemoglobin ở 560 nm [31].

Phổ huỳnh quang mô miệng là sự tổng hợp phổ huỳnh quang của tất cả các lớp cấu tạo nên niêm mạc miệng. Dựa vào kết quả mô phỏng ta thấy, niêm mạc miệng bị kích thích bởi bước sóng 365 nm sẽ phát bức xạ huỳnh quang ở vùng phổ khá rộng trải dài từ vùng tử ngoại (360 nm) đến vùng khả kiến (590 nm), trong đó cường độ tập trung mạnh trong dải 400 – 540 nm. Đây là vùng ánh sáng nhạy với mắt người, cho phép quan sát trực quan huỳnh quang niêm mạc miệng.

Theo các nghiên cứu trước đây, trong mơ miệng bình thường, huỳnh quang mô đệm xuất phát từ các sợi cấu trúc như collagen. Vì vậy, các sợicollagen được cho là các chất phát huỳnh quang chủ yếu trong mơ đệm bình thường và các tín hiệu quang học của các sợi này thì khác so với của NADH và FAD của biểu mô [31]. Với sự xuất hiện của mơ tổn thương, sẽ có sự mất mát lớn huỳnh quang mô đệm, đặc biệt vùng gần với màng đáy. Người ta giả thiết rằng, sự suy giảm huỳnh quang mô đệm trong trường hợp viêm mãn tính liên quan tới sự dịch chuyển của các sợi cấu trúc bởi các tế bào lympho infiltrating (đây là các tế bào ít có tính huỳnh quang), và đồng thời kích thích sự xuất hiện của các proteases matrix-degrading dẫn tới sự phá huỷ các sợi collagen. Ngồi ra sự mất mát hình quang trong ảnh huỳnh quang của các tổn thương ung thư và tiền ung thư là do sự phá huỷ của lớp nền collagen và sự hấp thụ của hemoglobin, sự tán xạ và bề dày của lớp biểu mơ tăng.

Do đó, tại vị trí niêm mạc miệng bị tổn thương quan sát thấy vùng tối so với các vị trí niêm mạc bình thường. Dựa vào ngun lý này thiết bị chẩn đốn khơng xâm lấn ung thư miệng bằng phương pháp phổ huỳnh quang đã và đang được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới phát triển.

35

* Ảnh huỳnh quang khoang miệng.

Hệ quang học được thiết kế ở mục 2.2.2 đã được sử dụng để khảo sát một số hình ảnh huỳnh quang từ một số tình nguyện viên có niêm mạc miệng bình thường. Trong hình 2.2.4 chúng tơi đưa ra hai hình ảnh so sánh: hình A, C lưỡi và mơi dưới